Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione dell'Università della Calabria.

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Action of the E2/ERβ/PTEN signaling in the metabolic reprogramming of TCam 2, human melanoma cell line
(2019-03-21) De Rose, Daniela; Andò, Sebastiano; Aquila, Saveria
I tumori maligni più abbondanti nella popolazione maschile di età compresa tra i 17 ed i 45 anni, sono i tumori delle cellule germinali (GCTs). Essi comprendono un gruppo eterogeneo di neoplasie in termini istologici, di marker d’espressione ed età di manifestazione. I tumori delle cellule germinali testicolari negli adolescenti e negli adulti (TGCTs) possono essere classificati in tumori seminomatosi (GCT di tipo II) e non seminomatosi. Nel nostro studio prenderemo in considerazione il GCT di tipo II, utilizzando come modello sperimentale la linea cellulare TCam2, ad oggi unica al mondo ampiamente caratterizzata e comprendente tutte le caratteristiche del seminoma umano, originata dalla lesione primaria di un seminoma testicolare sinistro di un paziente di 35 anni. La difficoltà di avere un modello cellulare valido per i tumori seminomatosi è il motivo principale che rende il tumore testicolare uno dei tumori meno studiati. La ricerca sul cancro testicolare continua ad investigare e studiare terapie volte ad indurre la morte nelle cellule tumorali. Recentemente, il metabolismo energetico è considerato un obiettivo innovativo nelle terapie antitumorali, in quanto le alterazioni metaboliche sono una caratteristica comune dei tessuti cancerosi. Il fenotipo metabolico maggiormente caratterizzante e per prima osservato nelle cellule cancerose è quello conosciuto come Effetto Warburg, che prevede la produzione di ATP attraverso la glicolisi invece che attraverso la fosforilazione ossidativa, anche in presenza di normali concentrazioni di ossigeno (Barger JF et al. 2010). Tuttavia, la riprogrammazione metabolica nei tumori si estende oltre l'Effetto Warburg. In effetti, la teoria classica sul metabolismo delle cellule tumorali (aumento dell'attività glicolitica e down-regolazione della fosforilazione ossidativa) è ancora oggetto di indagini in quanto numerosi studi hanno dimostrato che le cellule tumorali possono vivere in un ampio spettro di stati bioenergetici che variano dalla predominanza del fenotipo glicolitico, glicolitico parzialmente ossidativo, fino a quello prevalentemente fosforilativo (Smolková K et al. 2011). Gli estrogeni ed i loro recettori, sono in grado di modulare diversi aspetti del metabolismo cellulare come quello glucidico o lipidico, un’alterazione dei loro pathways trasduzionali è stata correlata infatti allo sviluppo di malattie metaboliche (Faulds Malin Hedengran, 2012). Nel nostro precedente studio abbiamo evidenziato un link tra ERβ/PTEN che attivato dall’estradiolo, induce la morte di tali cellule mediante autofagia e necroptosi (Guido C. et al. 2012). Poiché, morte cellulare e metabolismo energetico sono strettamente correlati, abbiamo ipotizzato che il link E2/ERβ/PTEN possa indurre una alterazione anche nella riprogrammazione metabolica nelle cellule di SE. Il ruolo di PTEN nella sopravvivenza e proliferazione cellulare è stato già riportato, inoltre PTEN è in grado di influenzare alcuni pathways metabolici come il metabolismo del glucosio (Madeline B, 2002), ed il metabolismo lipidico (Qiu W. 2008; Juan Liu, 2012; Ana Ortega-Molina and Manuel Serrano, 2013). Lo scopo di questo studio è quello di investigare un potenziale cross-talk funzionale tra E2, ERβ e PTEN nell’interferire sulla riprogrammazione metabolica delle cellule TCam2 di seminoma umano, così da ampliare le nostre conoscenze sul ruolo e sulla regolazione del gene PTEN oltre che sulla biologia di questo tipo di tumore. I nostri dati evidenziano un nuovo ruolo dell’ERβ come tumor suppressor, indicando che il meccanismo attraverso cui l’E2 induce la morte delle cellule TCam2 avviene anche attraverso l’alterazione della riprogrammazione metabolica in cooperazione con il gene PTEN. Ad oggi, il metabolismo di questa linea cellulare non è stato ancora investigato e pertanto il nostro lavoro contribuirà a migliorare le conoscenze su questo aspetto della biologia del seminoma umano. Concludendo, i nostri risultati supportano l’idea di una dipendenza estrogenica del tumore testicolare come già riportato in letteratura, indicando l’ERβ come possibile target terapeutico per il trattamento di questa condizione patologica.
Activated FXR inhibits leptin signaling and counteracts tumor-promoting activities of cancer-associated fibroblasts in breast malignancy
(2017-06-12) Vircillo, Valentina; Andò, Sebastiano; Catalano, Stefania
Cancer-associated fibroblasts (CAFs), the principal components of the tumor stroma, play a central role in cancer development and progression. As an important regulator of the crosstalk between breast cancer cells and CAFs, the cytokine leptin has been associated to breast carcinogenesis. The nuclear Farnesoid X Receptor-(FXR) seems to exert an oncosuppressive role in different tumors, including breast cancer. In this study, we demonstrated, for the first time, that the synthetic FXR agonist GW4064, inhibiting leptin signaling, affects the tumor-promoting activities of CAFs in breast malignancy. GW4064 inhibited growth, motility and invasiveness induced by leptin as well as by CAF-conditioned media in different breast cancer cell lines. These effects rely on the ability of activated FXR to increase the expression of the suppressor of the cytokine signaling 3 (SOCS3) leading to inhibition of leptin-activated signaling and downregulation of leptin-target genes. We further extend our data investigating whether FXR agonist may directly influence CAF phenotype. We demonstrated that FXR is expressed in different CAFs and treatment with GW 4064 is able to induce the transcription of key FXR target genes, including SHP (Small Heterodimer Partner) and BSEP (Bile Salt Export Pump). Interestingly, FXR activation is able to significantly reduce CAF motility, without influencing their proliferation capabilities. Accordingly, IPA (Ingenuity Pathway Analysis) on FXR-modulated genes highlighted cellular movement as the most significantly represented biologic process and evidenced a marked reduction in the activity of Rho signaling and Integrin proteins, with activation z-score of -1, -0,5 respectively. Moreover, our data showed a reduction in stress fibers formation in GW 4064 -treated CAFs. Activated FXR is able to reduce tumor promoting effects of CAFs on breast cancer cells, due to the ability of GW 4064 to reduce CAF secreted soluble factors, including IGF-1 (Insulin Growth Factor-1), FGF-9 (Fibroblast Growth Factor 9), TGF-3 (Transforming Growth Factor Beta 3) and others key mediators involved in the crosstalk tumor-stroma. Indeed, our data demonstrate how ER-breast cancer cell lines, MCF-7 and T47D, cocoltured with conditioned media derived from GW4064-treated CAFs, exhibit a significantly reduced anchorage-independent growth and migration. In vivo xenograft studies, using MCF-7 cells alone or co-injected with CAFs, showed that GW4064 administration markedly reduced tumor growth. Thus, FXR ligands might represent an emerging potential anti-cancer therapy able to block the tumor supportive role of activated fibroblasts within the breast microenvironment
Advanced and smart nanocarriers for pharmaceutical applications
(Università della Calabria, 2020-04-17) Mazzotta, Elisabetta; Andò, Sebastiano; Muzzalupo, Rita
The application of nanotechnology in drug formulation has made significant headway over the last decade. Nanoscale controlled release systems allow to revalue and reformulate old drugs through targeted delivery to the desired pathological site, improving therapeutic efficiency and reducing side effects. This innovative modality of drug delivery aims to create personalized, safer and effective treatments. A great interest of the academic and industrial research is focused on the design and development of advanced nanocarriers since is a profitable way in terms of costs, times and risks than the discovery of new drugs. Herein, an extensive variety of nanocarriers systems composed of different materials including lipids, polymers and non-ionic surfactants have been proposed for different pharmaceutical applications. Specifically, the carriers have been tailor-made designed to improve drug photostability, enhance skin permeation and realize smart tools for tumor target therapy.
Advanced functionalized materials for multipurpose applications
(Università della Calabria, 2021-03-21) Pantuso, Elvira; Andò, Sebastiano; Nicoletta, Fiore
Advanced materials for pharmaceutical and biomedical purposes
(2018-02-27) Mellace, Silvia; Andò, Sebastiano; Cassano, Roberta
L'innovazione nella chimica dei materiali e nella nanotecnologia hanno sinergicamente contribuito all'avanzamento e allo sviluppo dei Drug Delivery Systems (DDS) creando devices in grado di proteggere farmaci e sostanze biologicamente attive, aumentarne l'assorbimento, modificarne e migliorarne la penetrazione intracellulare e la distribuzione. Il presente lavoro ha avuto come obiettivo la progettazione, la preparazione e la caratterizzazione di materiali che potrebbero contribuire a trasformare e ottimizzare le performances di vari agenti terapeutici. In sintesi, sono stati preparati diversi dispositivi medici e DDS, utilizzando perlopiù polimeri, poiché esiste un grande potenziale nella combinazione di molecole bioattive con i polimeri, per affrontare sfide in campo farmaceutico e biomedico. Nella progettazione di questi nuovi materiali che sono biocompatibili e biologicamente attivi l’attenzione è stata anche focalizzata sull'applicazione di metodi in vitro e in silico per una previsione efficace ed efficiente dell’attività in vivo. In conclusione, la sintesi di nuovi materiali, l'adozione di polimeri naturali come carriers e una migliore comprensione del rapporto struttura-funzione hanno permesso lo sviluppo di DDS e devices con incoraggianti risultati sperimentali che suggeriscono un possibile utilizzo per una futura sperimentazione in ambito clinico
Application of computational methodologies toward the identification of novel therapeutics and photodegradation studies for the design of light-stable formulations
(Università della Calabria, 2021-06-10) Occhiuzzi, Maria Antonietta; Andò, Sebastiano; Grande, Fedora; Iole, Giuseppina
Baculovirus expression vector system. Sistema eucariotico per l'overespressione e la localizzazione subcellulare di proteine di membrana: studi di purificazione e caratterizzazione funzionale
(2013-10-28) Madeo,Marianna; Cappello,Anna Rita; Sisci,Diego
Benefits of advanced techniques and data processing for the analysis of complex biological and food matrices
(2019-03-03) Spatari, Claudia; Andò, Sebastiano; Ragno, Gaetano
Durante i tre anni di dottorato in Medicina Traslazionale, il mio lavoro di ricerca si è concentrato sull'applicazione di tecniche analitiche avanzate e sull'elaborazione dei dati per lo studio di matrici complesse biologiche e alimentari. Recenti studi hanno dimostrato che in circa il 10% dei campioni di latte materno acquistato online è presente DNA bovino che dimostra adulterazione intenzionale. I rischi associati al consumo da parte del neonato di latte umano adulterato con contaminanti animali o altro sono molti e gravi, tra cui carenza di ferro, disidratazione, aumento del potenziale di carico di soluto renale (PRSL) e reazioni allergiche, motivo per il quale risulta fondamentale la ricerca di eventuali adulteranti nel latte materno. L'applicazione di tecniche chemiometriche sullo spettro IR del latte materno si è dimostrata molto efficace nel tracciare anche minime variazioni nella composizione e nelle caratteristiche del latte umano, essendo in grado di sfruttare le informazioni non specifiche memorizzate nello spettro IR. In questo caso, l'elaborazione delle impronte digitali spettrali ATR-FTIR mediante regressione PCA e PLS, è stata in grado di rilevare l'aggiunta fraudolenta di acqua o latte di mucca. In particolare, la tecnica PLS-DA è risultata essenziale per riconoscere il latte materno puro dal latte adulterato. Un'ulteriore definizione di quattro modelli PLS1 ha consentito inoltre la determinazione della quantità di adulteranti specifici aggiunti. La ricerca sulle matrici alimentari è stata estesa a una serie di oli commestibili al fine di verificare la loro fotostabilità. Tecniche di irradiazione forzata, in combinazione con analisi spettroscopica UV-vis, FTIR-ATR e cromatografica HPLC-DAD, hanno mostrato cambiamenti quantitativi e qualitativi dei principali acidi grassi. La ricerca si è concentrata in seguito sull'olio di lino, data la sua grande importanza come alimento funzionale. Anche in questo caso, la spettroscopia UV e l'HPLC hanno rivelato cambiamenti significativi nella concentrazione di acidi grassi, ridotti al 35% dopo 48 ore di esposizione alla luce. La quantità di lignani, altri importanti componenti nutraceutici, ha invece mostrato una significativa stabilità. La fotoprotezione dell’olio di lino è stata in seguito dimostrata dall’uso di contenitori di vetro ambrato associato all’aggiunta di ascorbil palmitato quale agente antiossidante. I risultati ottenuti sono importanti per aumentare la durata di conservazione dell'olio di semi di lino o di altri oli commestibili, mediante l'adozione di formulazioni appropriate e accurata protezione fisica. Il monitoraggio dei farmaci nei fluidi biologici ha rappresentato un altro argomento importante del mio lavoro di tesi. Particolare attenzione è stata rivolta allo sviluppo di un metodo analitico per il monitoraggio della quantità dell’anestetico bupivacaina nel sangue del cordone ombelicale. La determinazione del farmaco è stata definita mediante un metodo di estrazione SPE seguito da analisi HPLC e GC-MS. Questo studio sta procedendo con l'analisi di un gran numero di campioni reali, al fine di valutare la sicurezza degli anestetici somministrati durante il parto naturale e nel contempo ottimizzare il protocollo terapeutico attualmente utilizzato in partoanalgesia. Un'esperienza fondamentale durante il dottorato è rappresentata dal periodo trascorso presso un laboratorio di ricerca dell'Università di Utrecht in Olanda. Qui ho avuto l'opportunità di studiare per un semestre (dal 26 settembre 2016 al 27 Marzo2017) presso il laboratorio di ricerca guidato dal prof. Rolf Sparidans. In tale occasione ho approfondito le mie conoscenze sull'uso della cromatografia LC-MS/MS applicata allo studio della farmacocinetica di nuovi farmaci antitumorali. In particolare ho partecipato allo studio di un saggio bioanalitico del farmaco lorlatinib, un inibitore ALK di terza generazione. La preparazione del campione e l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche sono state le fasi più impegnative del lavoro essendo stato il primo test sviluppato e validato per questo prodotto. Una procedura LC-MS / MS è stata ottimizzata e validata sul sangue di topi al fine di stabilirne le proprietà farmacocinetiche Ancora presso il gruppo di ricerca dell’Unical, parte dell’attività di ricerca è stata svolta su matrici farmaceutiche. In particolare si è studiata la stabilità in soluzione acquosa e alla luce di una 1,4-diidropiridina (siglata M3) di nuova sintesi, data la nota scarsa solubilità e fotolabilità di questa classe di farmaci. Una serie di tensioattivi, tra questi i tween, è stata testata per promuovere la solubilità in acqua, ottenendo risultati incoraggianti con l'uso del tensioattivo non ionico Tween20. Successivamente, la fotostabilità del complesso M3-Tween20 è stata studiata vagliando la capacità fotoprotettiva del materiale di diversi contenitori: quarzo, PET blu, PET ambrato, vetro scuro rivestito. La migliore fotoprotezione è stata garantita dal PET ambrato e dal contenitore in vetro scuro. I risultati ottenuti dimostrano che l'uso combinato di tensioattivi e contenitori specifici rappresenta una strategia interessante da applicare ai farmaci fotolabili e a carattere prevalentemente lipofilo
Bioactive compounds and properties of chinotto (citrus myrtfolia Raf.) at different ripening stages
(2016-02-26) Apriantini, Astari; Bartolini, ,Roberto; Fazio, Alessia
Citrus myrtifolia Raf. (chinotto) is a citrus fruit which originates from a mutation of Citrus aurantium (sour orange). This fruit has a small size and looks like a ping-pong. In Italy, The plant is cultivated in Calabria, Sicily and Liguria. The fruit of chinotto is widely used in food industry. Concentrated chinotto juice is a key ingredient in the production of soft drinks and liqueurs, whereas the whole fruit is used in the confectionery industry. However, despite its industrial applications, chinotto is among the least studied citrus fruit, with only a few reports present in the literature. Here, we studied bioactive compounds contained in all parts of chinotto fruit. We also investigated the changes of those bioactive compounds during maturation and different area cultivation. First, the oil content from the seeds were analyzed, in order to assess the fatty acid profiles. After that, the methanolic extracts and DMF extracts of the defatted seeds and pulps were analyzed for their total phenolic contents (TPC) and antioxidant capacities. The results showed that all those extracts had the ability to scavenge both DPPH and ABTS radicals. TPC value is highly dependent on the level of fruit maturity. Moreover, we also isolated the pectin and β-glucan from chinotto seeds and pulps, and characterized them using FT-IR, in order to provide the valuable information about the new alternative sources of pectin and β-glucan. Essential oils were extracted from the peels. The effects of maturation on the composition in volatile compounds of those essential oils were evaluated. After that, the potential antioxidant and anti-inflammatory properties of these fractions were tested. Our finding showed that essential oil obtained from semiripe chinotto peels effectively modulates inflammation in vitro and could, therefore, represent a potential attractive source of bioactive compounds for food, cosmetic, or pharmaceutical applications
Bisphenol A induces gene expression changes an proliferative effects through GPER in breast cancer celles and cancer-associated fibroblasts
(2012) Pupo, Marco; Maggiolini, Marcello; Sisci, Diego
Bisphenol A (BPA) is the principal constituent of baby bottles, reusable water bottles, metal cans, and plastic food containers. BPA exerts estrogen-like activity by interacting with the classical estrogen receptors (ER and ER ) and through the G protein-coupled receptor (GPR30/GPER). In this regard, recent studies have shown that GPER was involved in the proliferative effects induced by BPA in both normal and tumor cells. In this study we evaluated the transduction pathways through which BPA influences cell proliferation and migration in human breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs), that lack the classical ERs. Specific pharmacological inhibitors and gene-silencing procedures showed that BPA induces the expression of the GPER target genes c􀌻FOS, EGR􀌻1, and CTGF through the GPER/EGFR/ERK transduction signaling in SKBR3 breast cancer cells and CAFs. Moreover, we observed that GPER is required for growth effects and migration stimulated by BPA in both cell types. Our results indicate that GPER is involved in the biological action elicited by BPA in breast cancer cells and CAFs. Hence, GPER-mediated signaling should be included among the transduction mechanisms through which BPA may stimulate cancer progression
Breast tumor microenvironment and endocrine resistance: dissecting the molecular link
(Università della Calabria, 2023-07-04) Caruso, Amanda; Catalano, Stefania; Andò, Sebastiano
Caratterizzazione biochimico funzionale di una sottofamiglia proteica di Drosophila melanogaster correlata al trasportatore mitocondriale umano di acidi dicarbossilici
(2014-05-22) Mazzeo, Giancarlo; Dolce, Vincenza; Sisci, Diego
Caratterizzazione del profilo comportamentale e neurochimico dell'olio essenziale di bergamotto nel ratto
(2015-12-18) Tridico, Laura; Scisci, Diego; Morrone, Luigi Antonio
Caratterizzazione del profilo neurochimico, neuropatologico e neourofarmacologico di un modello sperimentale di glaucoma acuto
(2013-10-28) Cavaliere,Federica; Morrone,Luigi Antonio; Bagetta,Giacinto
Glaucoma is a leading cause of irreversibile blindness characterized by the progressive loss of retinal ganglion cells (RGCs). Elevated intraocular pressure is a major risk factor for glaucoma; however, medical therapies aimed to reduce intraocular pressure, are not always successful blocking the glaucoma‐associated retinal degeneration. This observation suggests that mechanisms other than intraocular pressure are also implicated in glaucomatous neurodegeneration. Experimental evidences suggest that alteration of glutamate homeostasis contributes to retinal dysfunction and neuropathy. However, the involvement of excitotoxicity in RGCs loss is still controversial. Therefore, the aim of the present study was to investigate the modulation of intravitreal glutamate levels in high intraocular pressure (IOP) induced ischemia, an established animal model that recapitulates features of acute angle closure glaucoma. Using this experimental model we monitored extracellular glutamate in the vitreous of rat before, during and after high IOPinduced ischemia. A significant increase of extracellular glutamate occurred during reperfusion, 10 and 150 minutes after ischemia. In our experimental setting, calpain activation is detected in the retina explants early after ischemia. Excess activation of calpain caused deleterious effects on RGCs, in fact we have observed 25.9% loss of cells in the RGCs layer at 7 days of the reperfusion. A pre‐treatment with coenzyme Q10 prevented retinal ganglion cells loss and inhibited the increase of glutamate observed in the vitreous during reperfusion. In addition, systemic pre‐treatment with 17α and 17β‐ estradiol, endowed with neuroprotective and antioxidant properties, minimized the elevation of glutamate observed during the reperfusion period. The reported effects seem to be only in part mediated by the activation of the estrogen receptor, since a pretreatment with ICI 182‐780, a specific estrogen receptor antagonist, partially counteracts the effect afforded by the estrogen in the early phase of reperfusion. In order to investigate the mechanisms supporting the observed increase of extracellular glutamate levels we performed ex‐vivo experiments using synaptosomes prepared from the retina of rats subjected to high IOP‐induced ischemia. Continuous superfusion of synaptosomes allowed a direct measurement of release and mechanisms involved. These data obtained indicated a reduced involvement of glutamate transporters in the mechanisms of release induced by KCl 15 mM in ischemic synaptosomes. In addition, in the same experimental conditions also the uptake is reduced. This is supported by reduced expression of the neuronal trasporter GLT1. Altogether these data, straighten the role of glutamate and oxidative stress in ischemiainduced RGCs death and demonstrate that the observed increase of intravitreal glutamate is associated to a reduction of the uptake and GLT1 expression.
Caratterizzazione del ruolo dell'autofagia in un modello sperimentale di glaucoma acuto
(2011) Varano, Giuseppe Pasquale; Sisci, Diego; Russo, Rossella
Il termine glaucoma indica un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche progressive caratterizzate da alterazioni del campo visivo dovute alla morte delle cellule ganglionari retiniche (Retinal Ganglion Cells, RGCs) e alla degenerazione del nervo ottico. Le strutture interessate in corso di glaucoma, retina e nervo ottico, costituiscono parte del sistema nervoso centrale (SNC), pertanto, il glaucoma è considerato, sotto ogni aspetto, una malattia neurodegenerativa. Così come per molte altre patologie neurodegenerative, l’eziologia del glaucoma è complessa e multifattoriale e la fisiopatologia cellulare e molecolare rimane poco sconosciuta. L’aumento della pressione intraoculare è considerato il principale fattore di rischio associato alla patologia, sebbene non sia la condizione necessaria e sufficiente per l'insorgenza della malattia e le cause responsabili della morte delle cellule ganglionari retiniche rimangono ancora ignote. Tuttavia, diversi sono i fattori che possono essere coinvolti per spiegare la perdita delle cellule ganglionari retiniche, fra questi: la deprivazione di fattori trofici, il danno da ischemia-riperfusione, lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale e l’eccitotossicità indotta dal glutammato. Il processo autofagico rappresenta il principale sistema di degradazione lisosomiale per il turnover di organelli e di proteine a lunga emivita. Questo processo permette alla cellula di eliminare componenti tossici o danneggiati allo scopo di mantenere i livelli energetici e l’omeostasi cellulare in condizioni di stress metabolico. Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che la disfunzione o la deregolazione autofagica è associata a diverse patologie neurodegenerative di tipo cronico, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington, ma anche di tipo acuto, come il danno ipossico e ischemico. Tuttavia, nonostante i numerosi studi sul ruolo dell’autofagia nelle malattie neurodegenerative, il ruolo di tale processo nella degenerazione retinica rimane ancora poco studiato. Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro di ricerca sono stati: - verificare la modulazione del processo autofagico in un modello sperimentale di glaucoma in vivo ottenuto attraverso l’aumento transitorio della pressione intraoculare con conseguente ischemia retinica. - valutare il ruolo dell’autofagia sulla vitalità cellulare in colture di cellule ganglionari retiniche RGC-5 attraverso la manipolazione farmacologica ed il silenziamento genico di proteine tipicamente coinvolte nel processo autofagico I risultati ottenuti dimostrano che l’insulto ischemico induce una riduzione significativa dell’espressione della forma associata all’autofagosoma della proteina LC3 (LC3II) e della proteina Beclin-1, coinvolta nelle fasi iniziali del processo autofagico. Quest’ultimo evento è accompagnato dal clivaggio proteolitico della proteina Beclin-1 nella fase post-ischemica con accumulo di un frammento proteico di 50kDa. L’attivazione della cascata eccitotossica, che consegue all’eccessiva stimolazione dei recettori NMDA per il glutammato, caratterizza l’insulto ischemico retinico e la morte delle cellule ganglionari ad esso associata. Nel presente lavoro è stata studiata l’attivazione delle proteasi Ca2+-dipendenti calpaine, tipicamente associate al fenomeno eccitotossico, in seguito all’induzione dell’ischemia retinica. Il profilo temporale di attivazione di questi enzimi proteolitici mostra un andamento compatibile con un loro coinvolgimento nel clivaggio della proteina Beclin-1. Il trattamento con l’antagonista non competitivo dei recettori NMDA del glutammato, l’MK- 801 (50nM, 5μl/occhio), con gli inibitori delle calpaine MDL28170 ed SJA6017 (1mM, 3μl/occhio) ed il silenziamento genico della subunità-1 delle calpaine in vivo (CAPNS1- siRNA, 10μg/occhio), mentre riducono l’attività delle proteasi, prevengono l’accumulo del frammento di 50kDa. L’insieme dei dati conferma il coinvolgimento delle calpaine nel clivaggio di Beclin-1, che viene pertanto identificata come un nuovo substrato di queste proteasi. Infine, il ruolo protettivo o detrimentale dell’autofagia è stato valutato in colture cellulari RGC-5 in vitro. La deprivazione da siero per un periodo di 24h induce l’attivazione dell’autofagia; il trattamento con gli inibitori del processo autofagico, Bafilomicina-A1 (100nM) e 3-metil-adenina (10mM), ed il silenziamento genico della proteina Beclin-1 in vitro riducono in modo significativo la vitalità delle RGC-5 in condizioni di deprivazione da siero. In conclusione, i dati riportati in questo studio indicano una deregolazione dell’autofagia in seguito all’ischemia/riperfusione retinica associata al clivaggio, mediato dalle calpaine, della proteina Beclin-1 e supportano il ruolo neuroprotettivo di questo processo nelle cellule ganglionari retiniche. Pertanto, la regolazione del processo autofagico potrebbe rappresentare un aspetto importante nelle patologie oculari associate ad eventi ischemici e quindi un potenziale bersaglio per nuove strategie neuroprotettive.
Caratterizzazione del ruolo svolto dal Nerve Growth Factor e dai suoi recettori nel differenziamento cellulare dei podociti umani
(2013-11-28) Carito, Valentina; Bagetta, Giacinto; Caroleo, Maria Cristina
Il Nerve Growth Factor (NGF) è una proteina solubile appartenente alla famiglia delle neurotrofine. Inizialmente scoperto e studiato per il suo ruolo chiave nello stimolare la crescita e il differenziamento neuronale, il NGF è oggi considerato un mediatore in grado di modulare l’attività biologica di svariate popolazioni cellulari non-neuronali. Le azioni biologiche del NGF sono mediate dal legame, sulle cellule target, a specifici recettori di membrana: il recettore ad alta affinità, TrkA, dotato di attività tirosinchinasica intrinseca e responsabile del controllo della sopravvivenza, del differenziamento e della proliferazione cellulare, e il recettore a bassa affinità, p75NTR, appartenente alla famiglia dei recettori di morte, in grado di indurre apoptosi o sopravvivenza cellulare. Diverse osservazioni sperimentali hanno documentato che il NGF e i suoi recettori sono presenti nel rene sano ed affetto da varie patologie, tuttavia è ancora poco nota l’esatta funzione che la neurotrofina riveste nel controllo dell’attività funzionale delle varie popolazioni cellulari renali. Nell'ambito della fisiopatologia renale un ruolo centrale è senz'altro svolto dai podociti, cellule dinamiche altamente specializzate, dotate di una sofisticata architettura cellulare e sub-cellulare, caratterizzate da un voluminoso corpo cellulare, lunghi processi primari e numerosi pedicelli. La funzione principale dei podociti è quella di garantire, insieme alle cellule endoteliali dei capillari glomerulari ed alla membrana glomerulare basale, la selettiva permeabilità di filtrazione della barriera glomerulare. L’integrità di tale struttura anatomica è sostenuta, oltre che dalla presenza di popolazioni cellulari specializzate anche dall’azione trofica esercitata da diversi fattori solubili di natura proteica, che agiscono sia in maniera autocrina che paracrina, tra i quali citochine e fattori di crescita. Poiché i podociti e le cellule nervose condividono diverse caratteristiche biologiche, l’espressione di molecole criticamente importanti per la loro funzione e il mantenimento della loro complessa struttura, nonché la stessa origine ontogenetica, il NGF potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella maturazione, nei cambiamenti strutturali e quindi nella funzione delle cellule podocitarie, analogamente a quanto già descritto a livello neuronale. I risultati del presente studio hanno evidenziato, per la prima volta, come i podociti umani immaturi, in corso di differenziamento e completamente differenziati, esprimono costitutivamente il messaggero per il NGF e per i suoi recettori, TrkA e p75NTR. Tale espressione genica è associata, in tutte le condizioni sperimentali, alla produzione, in forma matura, delle proteine recettoriali TrkA e p75NTR ed alla sintesi della neurotrofina in forma biologicamente attiva. L’analisi della distribuzione recettoriale a livello cellulare, condotta mediante microscopia elettronica, ha permesso di evidenziare che l’espressione sub-cellulare di entrambi i recettori varia in funzione dello stadio di maturazione podocitaria, con evidenti differenze nella localizzazione dei recettori ad alta e a bassa affinità, tra podociti proliferanti e podociti maturi. Di notevole interesse è l'evidenza, esclusivamente nella popolazione podocitaria indifferenziata, di una localizzazione di entrambi i recettori per la neurotrofina nel compartimento mitocondriale. L’analisi, mediante studi di immunoprecipitazione, dell'associazione tra i recettori TrkA e p75 e specifiche proteine mitocondriali, quali il traslocatore per il nucleotide adenina (ANT) e la fosfodiesterasi 4 isoforma A5 (PDE4A5), nonché l'evidenza di più elevati livelli di fosfo-ERK1/2 a livello del compartimento mitocondriale dei podociti immaturi rispetto a quelli proliferanti, ha consentito di ipotizzare, per la prima volta, un possibile ruolo del NGF e dei suoi recettori nel controllo dell'omeostasi energetica e nell'induzione di specifici pathways mitocondriali coinvolti nel mantenimento dello stato proliferativo. Gli studi volti a definire il ruolo funzionale del sistema NGF/recettori per il NGF nell’ambito della popolazione cellulare podocitaria hanno inoltre documentato come la deprivazione di NGF (mediante anticorpi anti-NGF), nei podociti immaturi, non ha alcun effetto sul ciclo cellulare, sull'espressione dei recettori per la neurotrofina e sulla loro distribuzione a livello subcellulare, mentre nei podociti in corso di differenziamento, l'esposizione agli anticorpi anti-NGF induce drammatiche alterazioni della morfologia cellulare, con perdita della corretta estensione dei pedicelli e notevole alterazione nell'organizzazione del citoscheletro. Si è anche osservata una riduzione selettiva dei livelli proteici di sinaptopodina, non associata a concomitante diminuzione dei livelli di mRNA, indicando un probabile effetto post-traduzionale della neurotrofina, probabilmente dovuto ad una riduzione dell’attività di fosforilazione della PKA che renderebbe così la sinaptopodina maggiormente esposta al clivaggio da parte della Lcatepsina. E’ noto che il recettore a bassa affinità per il NGF, p75NTR, è coinvolto nel controllo del pathway cAMP/PKA mediante interazione con la PDE4A. Studi di coimmunoprecipitazione del recettore per il NGF p75NTR con la PDE4A su lisati totali di podociti differenziati, di controllo o esposti al trattamento con anticorpi anti-NGF, hanno dimostrato che, nei podociti in corso di maturazione, la deprivazione di NGF induce un aumento dell’interazione p75-PDE4A5, cui consegue una riduzione dei livelli di cAMP e dell’attività della PKA; questo determina infine una maggiore esposizione della sinaptopodina all’attacco da parte della L-catepsina. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che il NGF ha un ruolo chiave nella fisiopatologia del podocita e, considerando l’enorme importanza che la neurotrofina sembra avere nell’ambito del corretto differenziamento podocitario e nel mantenimento della corretta morfologia cellulare, si intravedono possibili prospettive applicative del NGF quale valido strumento terapeutico nel trattamento di patologie renali croniche associate a proteinuria, dal momento che la compromissione della funzione podocitaria ne rappresenta l’evento patogenetico precoce e determinante
Caratterizzazione della citotossicità indotta dall'Olio Essenziale di Bergamotto (Citrus Bergamia,Risso) in colture di neuroblastoma umano ed identificazione dei componenti responsabili
(2013-10-31) Maida,Simona; Corasaniti,Maria Tiziana; Bagetta,Giacinto
Caratterizzazione fisiopatologica e farmacologica di un modello sperimentale di dolore neuropatico da legatura del nervo spinale L5 nel topo
(2008) Levato, Alessandra; Bagetta, Giacinto
Caratterizzazione pre-clinica di una nuova strategia terapeutica per l'ischemia cerebrale identificata mediante drug repurposing di un antibiotico macrolide
(2013-11-30) Certo, Michelangelo; Amantea, Diana; Sisci, Diego
Cerebral ischemia is one of the most common causes of disability and mortality worldwide and the only pharmacological treatment currently available is thrombolysis. The understanding of the mechanisms underlying ischemic injury has led to the identification of several neuroprotective compounds aimed at the recovery of the damaged brain tissue. However, most of these drugs have produced disappointing results in clinical trials because of the high toxicity or lack of efficacy in patients. Therefore, there is a real need to develop novel therapeutic strategies that do not consider neurons as the only target. In fact, the neuronal damage is strongly influenced by the inflammatory and immune processes that develop both locally and systemically after ischemia. The inflammatory response evolves slowly, and this allows to significantly expand the time window for pharmacological intervention, highlighting the therapeutic potential of anti-inflammatory and immunomodulatory drugs. Therefore, the first objective of this work was to characterize central and peripheral inflammatory responses that occur following an ischemic insult in rodents. In particular, in order to identify potential targets, we have evaluated the temporal profile of activation of specific inflammatory cells. By immunofluorescence analysis, we observed an early activation of microglia and astrocytes in the ischemic hemisphere, as a result of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) in rodents. We have also detected a massive brain recruitment of neutrophils and macrophages, with a peak of infiltration 48 hours after the insult, whereas T lymphocytes have been identified only at later times. Together with evidence from microarray studies demonstrating that the majority of genes modulated acutely in the blood of stroke patients resides in neutrophils and monocytes, our findings suggest that these cells may be useful therapeutic targets. Using the repurposing approach we have selected a drug, azithromycin, that is able to modulate the functions of macrophages and neutrophils in pathological conditions other than ischemia. Pre-treatment with azithromycin (150 mg/kg, orally) produces a significant reduction of the cerebral infarct volume induced by transient or permanent MCAo in rats. This suggests a potential prophylactic use of the drug during surgical procedures associated to a high risk of ischemic tissue damage. We have also observed the neuroprotective activity of azithromycin when the drug is administered systemically after a transient ischemic insult. The reduction of the infarct volume induced by transient MCAo is dose-dependent (ED50 = 0.59 mg/kg in mice, ED50 = 1.19 mg/kg in rats) and is approximately 60% (compared to vehicle) with the most effective dose of azithromycin (150 mg/kg, i.p.). The neuroprotective doses in rodents are therefore much lower than the antibiotic ones. We have also documented that the reduction of the infarct volume and the improvement of the neurological deficit due to azithromycin post-treatment (150 mg/kg, ip) are maintained up to 7 days after the insult. Furthermore, the time window of efficacy is rather wide, since neuroprotection is observed with the drug administered up to 6 hours after the insult both in rats and in mice subjected to transient MCAo. The characterization of the neuroprotective effects of azithromycin, demonstrated by the present study in models of focal ischemia in rodents, provides the basis for the validation of the drug efficacy in patients suffering from ischemic stroke.
Characterization of the role of ageing on mechanical and thermal nociception and nocifensive response to formalin test in C57BL/6 Mice
(2014-10-27) Scuteri, Damiana; Sisci, Diego; Berliocchi, Laura
Il dolore cronico, che riduce notevolmente la qualità della vita, interessa un vasto segmento della popolazione globale (il 25% della popolazione Europea e più di 100 milioni di cittadini Americani), diventando anche più frequente negli anziani (> 65 anni). In questa popolazione, il dolore cronico spesso viene incompreso e non opportunamente trattato (Bruckenthal & D’Arcy, 2007), anche a causa della resistenza alla maggior parte degli analgesici di elezione. Pertanto, questo progetto di dottorato è stato condotto con l’obiettivo di caratterizzare un modello di dolore cronico che potesse essere un valido strumento rappresentativo della condizione di dolore cronico nell’anziano ed il ruolo dell’invecchiamento nella nocicezione meccanica e termica e nella risposta nocifensiva in topi C57BL/6. Topi C57BL/6 di due mesi di età sono stati sottoposti al Test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977): oltre a studiare il comportamento nocifensivo di licking/biting/flinching indotto dalla formalina, l’allodinia meccanica e l’edema sviluppati dagli animali in seguito alla somministrazione di formalina sono stati rispettivamente investigati tramite il Test di Von Frey (Chaplan et al., 1994) e l’utilizzo di un calibro, nel 1°, 4°, 7°, 9°, 11° e 14° giorno successivo alla somministrazione di formalina. Inoltre, è stata studiata l’efficacia del gabapentin, uno dei trattamenti di scelta per gli stati di dolore cronico come la neuropatia diabetica e la nevralgia postherpetica (Backonja et al., 1998; Rowbotham et al., 1998), sia nella risposta nocifensiva al test della formalina sia nella conseguente allodinia meccanica, fino a 4 giorni dopo l’iniezione di formalina. I risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza di allodinia meccanica nella zampa ipsilaterale già due ore dopo la somministrazione di formalina, con il picco nel 4° giorno. Questa allodinia meccanica a lungo termine (fino a 14 giorni), nel 4° giorno successivo all’iniezione di formalina, interessa anche la zampa controlaterale, confermando l’esistenza di meccanismi centrali ritenuti alla base della seconda fase del test della formalina ed escludendo la possibilità che tale allodinia possa essere causata dall’edema evidenziato. Il gabapentin è risultato molto efficace nella seconda fase, lievemente efficace nella prima fase e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina 2 ore dopo la somministrazione di formalina. Tale attività non è stata evidenziata nel primo e nel quarto giorno successivo all’iniezione di formalina, verosimilmente a causa dell’emivita del farmaco. I nostri risultati caratterizzano il test della formalin come un modello rappresentativo di uno stato di dolore cronico che racchiude sia le caratteristiche infiammatorie del dolore articolare, spesso resistente al trattamento (Scaglione et al., 2014), sia gli aspetti centrali del dolore neuropatico, perciò molto utile per studiare le condizioni di dolore cronico che affliggono un crescente numero di pazienti anziani. Inoltre, il quadro fisiopatologico del dolore nell’anziano è stato approfondito per comprendere come l’invecchiamento potesse influenzare prima la nocicezione e, successivamente, lo sviluppo ed il mantenimento del dolore, dal momento che i cambiamenti nella nocicezione indotti dall’età non sono ancora ben noti (Taguchi et al., 2010). Pertanto, topi C57BL/6 giovani (2 mesi) e più anziani (6, 12 e 18 mesi) sono stati sottoposti a test comportamentali per determinare la sensibilità basale meccanica e termica (test di Von Frey (Chaplan et al., 1994), Pin-prick test (Chan et al., 1992), test di Hargreaves (Hargreaves et al., 1988), test dell’acetone (Choi et al., 1994)). Come dimostrato anche da studi longitudinali, soprattutto la sensibilità meccanica ed anche quella termica (sia al caldo che al freddo) sono risultate incrementate. I primi cambiamenti evidenti, in particolare per la sensibilità al freddo, sono stati osservati intorno ai 6 mesi di età. Fra l’età di 12 e di 18 mesi, i livelli di sensibilità hanno mostrato una sorta di plateau, con un incremento molto più lento. Poiché la nocicezione è risultata essere modificata negli animali anziani, si è deciso di esaminare l’effetto dell’età sulla risposta nocifensiva al dolore evocato (test della formalina). La risposta nocicettiva, espressa in secondi di licking/biting/flinching e come totale di eventi di licking/biting/flinching, è risultata differente nei topi anziani (6, 12, 18 mesi), presentando non più solo 2 ma 3 fasi di picco, uno spostamento temporale ed un’ampiezza variata. Inoltre, lo stato allodinico formalina-indotto è risultato più pronunciato nei topi anziani, nei quali l’allodinia meccanica ha continuato ancora a rimanere stabile al picco, mentre nei topi di due mesi il recupero stava già cominciando. Anche il processo di guarigione e l’edema della zampa sono risultati influenzati dall’età dell’animale. A livello molecolare, non sono state evidenziate differenze significative nei livelli della proteina p62, di LC3- I e di LC3-II, mentre solo i livelli di espressione di Beclin 1 sono risultati progressivamente ridotti con l’invecchiamento, in maniera statisticamente significativa. Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, questi risultati sembrano suggerire che la pathway dell’autofagia sia modificata e che il flusso autofagico sia probabilmente ridotto. Di fondamentale importanza è l’osservazione che il principale marker di dolore cronico, la subunità del canale del Ca2+ α2δ-1, è risultata quasi assente nei topi di 2 mesi e notevolmente up-regolata, seguendo un andamento a campana, nei topi di 6 e di 12 mesi. Questo fenomeno potrebbe essere alla base della ridotta soglia meccanica dei topi più anziani. Inoltre, una nuova banda a basso peso molecolare, che abbiamo chiamato α2δ-1*, è risultata altamente presente nei topi più anziani rispetto ai topi di due mesi, come la banda nota α2δ-1. I nostri risultati hanno dimostrato che anche l’efficacia del gabapentin (10 e 100 mg/Kg) nel test della formalina e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina, testato in topi C57BL/6 di 2 e 6 mesi, è risultata influenzata dall’invecchiamento. In particolare, nei topi giovani, solo la dose di 100 mg/Kg è risultata efficace in tutte le fasi del test della formalina, mentre, sia la dose più alta che la dose più bassa sono state efficaci nei topi di 6 mesi. A differenza dei topi di due mesi, i topi di 6 mesi non hanno mostrato cambiamenti significativi fra la soglia meccanica dei topi trattati con veicolo e quella dei topi trattati con il farmaco due ore dopo la somministrazione di formalina. Tuttavia, la somministrazione acuta di gabapentin è risultata più efficace sull’allodinia meccanica indotta dalla formalina nei topi di 6 che nei topi di 2 mesi, suggerendo che nei topi anziani, anche una dose più bassa di gabapentin risulta terapeutica ma l’effetto terapeutico ha più breve durata. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto all’up-regulation della subunità α2δ-1 evidenziata nei topi anziani. In conclusione, i risultati ottenuti durante questo progetto di ricerca di dottorato caratterizzano il test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977) come un valido modello di dolore cronico e dimostrano che il processo di invecchiamento influenza la soglia nocicettiva agli stimoli sia di natura meccanica che termica ed il comportamento nocifensivo in tale modello sperimentale di dolore cronico. I nostri risultati sono dotati di un notevole valore traslazionale per rispondere al bisogno, non ancora soddisfatto, di un migliore sfruttamento degli strumenti farmacologici già disponibili e di nuovi trattamenti terapeutici per la gestione del dolore cronico nei pazienti anziani.