Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione

Il Nerve Growth Factor (NGF) è una proteina solubile appartenente alla famiglia delle neurotrofine. Inizialmente scoperto e studiato per il suo ruolo chiave nello stimolare la crescita e il differenziamento neuronale, il NGF è oggi considerato un mediatore in grado di modulare l’attività biologica di svariate popolazioni cellulari non-neuronali. Le azioni biologiche del NGF sono mediate dal legame, sulle cellule target, a specifici recettori di membrana: il recettore ad alta affinità, TrkA, dotato di attività tirosinchinasica intrinseca e responsabile del controllo della sopravvivenza, del differenziamento e della proliferazione cellulare, e il recettore a bassa affinità, p75NTR, appartenente alla famiglia dei recettori di morte, in grado di indurre apoptosi o sopravvivenza cellulare. Diverse osservazioni sperimentali hanno documentato che il NGF e i suoi recettori sono presenti nel rene sano ed affetto da varie patologie, tuttavia è ancora poco nota l’esatta funzione che la neurotrofina riveste nel controllo dell’attività funzionale delle varie popolazioni cellulari renali. Nell'ambito della fisiopatologia renale un ruolo centrale è senz'altro svolto dai podociti, cellule dinamiche altamente specializzate, dotate di una sofisticata architettura cellulare e sub-cellulare, caratterizzate da un voluminoso corpo cellulare, lunghi processi primari e numerosi pedicelli. La funzione principale dei podociti è quella di garantire, insieme alle cellule endoteliali dei capillari glomerulari ed alla membrana glomerulare basale, la selettiva permeabilità di filtrazione della barriera glomerulare. L’integrità di tale struttura anatomica è sostenuta, oltre che dalla presenza di popolazioni cellulari specializzate anche dall’azione trofica esercitata da diversi fattori solubili di natura proteica, che agiscono sia in maniera autocrina che paracrina, tra i quali citochine e fattori di crescita. Poiché i podociti e le cellule nervose condividono diverse caratteristiche biologiche, l’espressione di molecole criticamente importanti per la loro funzione e il mantenimento della loro complessa struttura, nonché la stessa origine ontogenetica, il NGF potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella maturazione, nei cambiamenti strutturali e quindi nella funzione delle cellule podocitarie, analogamente a quanto già descritto a livello neuronale. I risultati del presente studio hanno evidenziato, per la prima volta, come i podociti umani immaturi, in corso di differenziamento e completamente differenziati, esprimono costitutivamente il messaggero per il NGF e per i suoi recettori, TrkA e p75NTR. Tale espressione genica è associata, in tutte le condizioni sperimentali, alla produzione, in forma matura, delle proteine recettoriali TrkA e p75NTR ed alla sintesi della neurotrofina in forma biologicamente attiva. L’analisi della distribuzione recettoriale a livello cellulare, condotta mediante microscopia elettronica, ha permesso di evidenziare che l’espressione sub-cellulare di entrambi i recettori varia in funzione dello stadio di maturazione podocitaria, con evidenti differenze nella localizzazione dei recettori ad alta e a bassa affinità, tra podociti proliferanti e podociti maturi. Di notevole interesse è l'evidenza, esclusivamente nella popolazione podocitaria indifferenziata, di una localizzazione di entrambi i recettori per la neurotrofina nel compartimento mitocondriale. L’analisi, mediante studi di immunoprecipitazione, dell'associazione tra i recettori TrkA e p75 e specifiche proteine mitocondriali, quali il traslocatore per il nucleotide adenina (ANT) e la fosfodiesterasi 4 isoforma A5 (PDE4A5), nonché l'evidenza di più elevati livelli di fosfo-ERK1/2 a livello del compartimento mitocondriale dei podociti immaturi rispetto a quelli proliferanti, ha consentito di ipotizzare, per la prima volta, un possibile ruolo del NGF e dei suoi recettori nel controllo dell'omeostasi energetica e nell'induzione di specifici pathways mitocondriali coinvolti nel mantenimento dello stato proliferativo. Gli studi volti a definire il ruolo funzionale del sistema NGF/recettori per il NGF nell’ambito della popolazione cellulare podocitaria hanno inoltre documentato come la deprivazione di NGF (mediante anticorpi anti-NGF), nei podociti immaturi, non ha alcun effetto sul ciclo cellulare, sull'espressione dei recettori per la neurotrofina e sulla loro distribuzione a livello subcellulare, mentre nei podociti in corso di differenziamento, l'esposizione agli anticorpi anti-NGF induce drammatiche alterazioni della morfologia cellulare, con perdita della corretta estensione dei pedicelli e notevole alterazione nell'organizzazione del citoscheletro. Si è anche osservata una riduzione selettiva dei livelli proteici di sinaptopodina, non associata a concomitante diminuzione dei livelli di mRNA, indicando un probabile effetto post-traduzionale della neurotrofina, probabilmente dovuto ad una riduzione dell’attività di fosforilazione della PKA che renderebbe così la sinaptopodina maggiormente esposta al clivaggio da parte della Lcatepsina. E’ noto che il recettore a bassa affinità per il NGF, p75NTR, è coinvolto nel controllo del pathway cAMP/PKA mediante interazione con la PDE4A. Studi di coimmunoprecipitazione del recettore per il NGF p75NTR con la PDE4A su lisati totali di podociti differenziati, di controllo o esposti al trattamento con anticorpi anti-NGF, hanno dimostrato che, nei podociti in corso di maturazione, la deprivazione di NGF induce un aumento dell’interazione p75-PDE4A5, cui consegue una riduzione dei livelli di cAMP e dell’attività della PKA; questo determina infine una maggiore esposizione della sinaptopodina all’attacco da parte della L-catepsina. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che il NGF ha un ruolo chiave nella fisiopatologia del podocita e, considerando l’enorme importanza che la neurotrofina sembra avere nell’ambito del corretto differenziamento podocitario e nel mantenimento della corretta morfologia cellulare, si intravedono possibili prospettive applicative del NGF quale valido strumento terapeutico nel trattamento di patologie renali croniche associate a proteinuria, dal momento che la compromissione della funzione podocitaria ne rappresenta l’evento patogenetico precoce e determinante

Vitamin A (Retinol) plays a central role in many essential biological processes such as vision, immunity, reproduction, growth, development, control of cellular proliferation and differentiation. The main active forms of retinol, not primary involved in vision, are alltrans retinoic acid and 9-cis retinoic acid, both able to act at nuclear level by binding their receptors RAR and RXR and modulating many physiological processes. However, the nuclear action of vitamin A derivatives is not the only mechanism of retinoic acid (RA) acting on cells. RA is able to modify covalently proteins via a post-translational modification, named retinoylation that has been shown to occur at physiological concentration on pre-existing proteins and localized mainly in the mitochondrial compartment. The present study has been focused on the non genomic action of RA on steroidogenic tissues, testes and adrenal glands, giving further details on the ability of RA to influence protein activity and therefore cell physiology. In particular RA effects on mitochondria from the adrenal glands and the 2-oxoglutarate carrier protein from testes and TM-3 Leydig cell line were studied, providing new data on the peculiarity of steroidogenic tissues to incorporate RA at dietary levels and demonstrating how the shuttling of reducing equivalent across the mitochondrial membrane is influenced by RA treatment. Looking for the biochemical mechanism of RA action on the Adenine Nucleotide Translocator, that exchanges ATP for ADP between mitochondria and cytosol, for the first time, it was possible to demonstrate how the activity of this carrier protein is positively modulated by the Coenzyme A, a fundamental component of the retynoilating buffer. At pharmacological levels, retinoids are also active compounds in the treatment of cancer due to the capability to promote cell differentiation and their pro-apoptotic activity. In this latter concern, the mechanisms of nutriceutical concentration of 9-cis RA, together with nanomolar concentration of the selective PPARγ ligand, rosiglitazone, to promote apoptosis in breast cancer cell lines, have been investigated. The data lay the basis for a potential use of the combined therapy with low doses of both BRL and 9-cis RA as novel therapeutic tool particularly for breast cancer patients who develop resistance to antiestrogen therapy

Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato

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