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    Caratterizzazione del ruolo dell'autofagia in un modello sperimentale di glaucoma acuto
    (2011) Varano, Giuseppe Pasquale; Sisci, Diego; Russo, Rossella
    Il termine glaucoma indica un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche progressive caratterizzate da alterazioni del campo visivo dovute alla morte delle cellule ganglionari retiniche (Retinal Ganglion Cells, RGCs) e alla degenerazione del nervo ottico. Le strutture interessate in corso di glaucoma, retina e nervo ottico, costituiscono parte del sistema nervoso centrale (SNC), pertanto, il glaucoma è considerato, sotto ogni aspetto, una malattia neurodegenerativa. Così come per molte altre patologie neurodegenerative, l’eziologia del glaucoma è complessa e multifattoriale e la fisiopatologia cellulare e molecolare rimane poco sconosciuta. L’aumento della pressione intraoculare è considerato il principale fattore di rischio associato alla patologia, sebbene non sia la condizione necessaria e sufficiente per l'insorgenza della malattia e le cause responsabili della morte delle cellule ganglionari retiniche rimangono ancora ignote. Tuttavia, diversi sono i fattori che possono essere coinvolti per spiegare la perdita delle cellule ganglionari retiniche, fra questi: la deprivazione di fattori trofici, il danno da ischemia-riperfusione, lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale e l’eccitotossicità indotta dal glutammato. Il processo autofagico rappresenta il principale sistema di degradazione lisosomiale per il turnover di organelli e di proteine a lunga emivita. Questo processo permette alla cellula di eliminare componenti tossici o danneggiati allo scopo di mantenere i livelli energetici e l’omeostasi cellulare in condizioni di stress metabolico. Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che la disfunzione o la deregolazione autofagica è associata a diverse patologie neurodegenerative di tipo cronico, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington, ma anche di tipo acuto, come il danno ipossico e ischemico. Tuttavia, nonostante i numerosi studi sul ruolo dell’autofagia nelle malattie neurodegenerative, il ruolo di tale processo nella degenerazione retinica rimane ancora poco studiato. Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro di ricerca sono stati: - verificare la modulazione del processo autofagico in un modello sperimentale di glaucoma in vivo ottenuto attraverso l’aumento transitorio della pressione intraoculare con conseguente ischemia retinica. - valutare il ruolo dell’autofagia sulla vitalità cellulare in colture di cellule ganglionari retiniche RGC-5 attraverso la manipolazione farmacologica ed il silenziamento genico di proteine tipicamente coinvolte nel processo autofagico I risultati ottenuti dimostrano che l’insulto ischemico induce una riduzione significativa dell’espressione della forma associata all’autofagosoma della proteina LC3 (LC3II) e della proteina Beclin-1, coinvolta nelle fasi iniziali del processo autofagico. Quest’ultimo evento è accompagnato dal clivaggio proteolitico della proteina Beclin-1 nella fase post-ischemica con accumulo di un frammento proteico di 50kDa. L’attivazione della cascata eccitotossica, che consegue all’eccessiva stimolazione dei recettori NMDA per il glutammato, caratterizza l’insulto ischemico retinico e la morte delle cellule ganglionari ad esso associata. Nel presente lavoro è stata studiata l’attivazione delle proteasi Ca2+-dipendenti calpaine, tipicamente associate al fenomeno eccitotossico, in seguito all’induzione dell’ischemia retinica. Il profilo temporale di attivazione di questi enzimi proteolitici mostra un andamento compatibile con un loro coinvolgimento nel clivaggio della proteina Beclin-1. Il trattamento con l’antagonista non competitivo dei recettori NMDA del glutammato, l’MK- 801 (50nM, 5μl/occhio), con gli inibitori delle calpaine MDL28170 ed SJA6017 (1mM, 3μl/occhio) ed il silenziamento genico della subunità-1 delle calpaine in vivo (CAPNS1- siRNA, 10μg/occhio), mentre riducono l’attività delle proteasi, prevengono l’accumulo del frammento di 50kDa. L’insieme dei dati conferma il coinvolgimento delle calpaine nel clivaggio di Beclin-1, che viene pertanto identificata come un nuovo substrato di queste proteasi. Infine, il ruolo protettivo o detrimentale dell’autofagia è stato valutato in colture cellulari RGC-5 in vitro. La deprivazione da siero per un periodo di 24h induce l’attivazione dell’autofagia; il trattamento con gli inibitori del processo autofagico, Bafilomicina-A1 (100nM) e 3-metil-adenina (10mM), ed il silenziamento genico della proteina Beclin-1 in vitro riducono in modo significativo la vitalità delle RGC-5 in condizioni di deprivazione da siero. In conclusione, i dati riportati in questo studio indicano una deregolazione dell’autofagia in seguito all’ischemia/riperfusione retinica associata al clivaggio, mediato dalle calpaine, della proteina Beclin-1 e supportano il ruolo neuroprotettivo di questo processo nelle cellule ganglionari retiniche. Pertanto, la regolazione del processo autofagico potrebbe rappresentare un aspetto importante nelle patologie oculari associate ad eventi ischemici e quindi un potenziale bersaglio per nuove strategie neuroprotettive.
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    Biomechanics of the human eye slera
    (2014-02-14) Fazio,Massimo Antonio; Bruno,Luigi; Rizzuti,Sergio
    The biomechanics of the optic nerve head and peripapillary sclera have been hypothesized to play a central role in the individual susceptibility to glaucoma, which is the second leading cause of blindness worldwide. The aim of this work is to provide a mechanical testing and experimental data analysis procedure to characterize mechanical properties of human sclera. The overall goal of performing scleral tissue mechanical testing is to elucidate the role of ocular biomechanics in the development of this disease by constructing eye-specific finite element models of the posterior pole. In this work it has been developed and validated a new methodology for computing sub-micrometer scale IOP-induced deformation obtained during pressurization testing of human scleral shells. Genetic Algorithm-based procedure and a microstructure-based numerical fitting method have been adopted to assess structural material properties of the testes eyes. Preliminaries results show the range of nonlinear, anisotropic mechanical properties of posterior sclera from normal eyes of human donors.
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    Caratterizzazione del profilo neurochimico, neuropatologico e neourofarmacologico di un modello sperimentale di glaucoma acuto
    (2013-10-28) Cavaliere,Federica; Morrone,Luigi Antonio; Bagetta,Giacinto
    Glaucoma is a leading cause of irreversibile blindness characterized by the progressive loss of retinal ganglion cells (RGCs). Elevated intraocular pressure is a major risk factor for glaucoma; however, medical therapies aimed to reduce intraocular pressure, are not always successful blocking the glaucoma‐associated retinal degeneration. This observation suggests that mechanisms other than intraocular pressure are also implicated in glaucomatous neurodegeneration. Experimental evidences suggest that alteration of glutamate homeostasis contributes to retinal dysfunction and neuropathy. However, the involvement of excitotoxicity in RGCs loss is still controversial. Therefore, the aim of the present study was to investigate the modulation of intravitreal glutamate levels in high intraocular pressure (IOP) induced ischemia, an established animal model that recapitulates features of acute angle closure glaucoma. Using this experimental model we monitored extracellular glutamate in the vitreous of rat before, during and after high IOPinduced ischemia. A significant increase of extracellular glutamate occurred during reperfusion, 10 and 150 minutes after ischemia. In our experimental setting, calpain activation is detected in the retina explants early after ischemia. Excess activation of calpain caused deleterious effects on RGCs, in fact we have observed 25.9% loss of cells in the RGCs layer at 7 days of the reperfusion. A pre‐treatment with coenzyme Q10 prevented retinal ganglion cells loss and inhibited the increase of glutamate observed in the vitreous during reperfusion. In addition, systemic pre‐treatment with 17α and 17β‐ estradiol, endowed with neuroprotective and antioxidant properties, minimized the elevation of glutamate observed during the reperfusion period. The reported effects seem to be only in part mediated by the activation of the estrogen receptor, since a pretreatment with ICI 182‐780, a specific estrogen receptor antagonist, partially counteracts the effect afforded by the estrogen in the early phase of reperfusion. In order to investigate the mechanisms supporting the observed increase of extracellular glutamate levels we performed ex‐vivo experiments using synaptosomes prepared from the retina of rats subjected to high IOP‐induced ischemia. Continuous superfusion of synaptosomes allowed a direct measurement of release and mechanisms involved. These data obtained indicated a reduced involvement of glutamate transporters in the mechanisms of release induced by KCl 15 mM in ischemic synaptosomes. In addition, in the same experimental conditions also the uptake is reduced. This is supported by reduced expression of the neuronal trasporter GLT1. Altogether these data, straighten the role of glutamate and oxidative stress in ischemiainduced RGCs death and demonstrate that the observed increase of intravitreal glutamate is associated to a reduction of the uptake and GLT1 expression.