Tesi di Dottorato
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Item Molecular simulation of transport proteins in interaction with physiological and pharmacological ligands(2014-11-13) Evoli, Stefania; Bartolino, Roberto; Carbone, Vincenzo; Guzzi, Rita; Rizzuti, BrunoMolecular complexes of transport proteins with small compounds have been studied by using docking techniques and molecular dynamics simulations. The macromolecules considered are β- lactoglobulin and albumin, i.e. the most abundant proteins in bovine milk and human blood serum, respectively. The ligands are long-chain fatty acids of different length and ibuprofen, a molecule of pharmaceutical interest. Simulations of β-lactoglobulin with fatty acids, ranging from caprylic to stearic acid, revealed the key protein residues that contribute to the binding process. In particular, a rationale was found for the high binding affinity of both stearic and palmitic acid compared to shorter lipids. Moreover, the location of two low-affinity external binding sites was predicted for palmitic acid, by comparing docking results with those obtained for vitamin D3, for which an external site has already been identified in crystallography. For human serum albumin, docking results suggest different candidate binding locations for both charged and neutral ibuprofen. An alchemical free energy approach has been used to estimate the binding affinity for each pose. The results show that charged ibuprofen has a greater affinity for albumin compared to the ligand in the neutral form, suggesting that the former corresponds to the physiological binding state. The simulation findings were compared to experimental results and show an overall good agreement, predicting details of the protein-ligand interaction that include binding geometries and contacts with specific amino acid residues. The overall findings reveal significant features of the binding of well-known ligands to two extensively investigated transport proteins, and show how computational tools can be used to support experimental techniques in a variety of cases.Item Caratterizzazione del ruolo svolto dal Nerve Growth Factor e dai suoi recettori nel differenziamento cellulare dei podociti umani(2013-11-28) Carito, Valentina; Bagetta, Giacinto; Caroleo, Maria CristinaIl Nerve Growth Factor (NGF) è una proteina solubile appartenente alla famiglia delle neurotrofine. Inizialmente scoperto e studiato per il suo ruolo chiave nello stimolare la crescita e il differenziamento neuronale, il NGF è oggi considerato un mediatore in grado di modulare l’attività biologica di svariate popolazioni cellulari non-neuronali. Le azioni biologiche del NGF sono mediate dal legame, sulle cellule target, a specifici recettori di membrana: il recettore ad alta affinità, TrkA, dotato di attività tirosinchinasica intrinseca e responsabile del controllo della sopravvivenza, del differenziamento e della proliferazione cellulare, e il recettore a bassa affinità, p75NTR, appartenente alla famiglia dei recettori di morte, in grado di indurre apoptosi o sopravvivenza cellulare. Diverse osservazioni sperimentali hanno documentato che il NGF e i suoi recettori sono presenti nel rene sano ed affetto da varie patologie, tuttavia è ancora poco nota l’esatta funzione che la neurotrofina riveste nel controllo dell’attività funzionale delle varie popolazioni cellulari renali. Nell'ambito della fisiopatologia renale un ruolo centrale è senz'altro svolto dai podociti, cellule dinamiche altamente specializzate, dotate di una sofisticata architettura cellulare e sub-cellulare, caratterizzate da un voluminoso corpo cellulare, lunghi processi primari e numerosi pedicelli. La funzione principale dei podociti è quella di garantire, insieme alle cellule endoteliali dei capillari glomerulari ed alla membrana glomerulare basale, la selettiva permeabilità di filtrazione della barriera glomerulare. L’integrità di tale struttura anatomica è sostenuta, oltre che dalla presenza di popolazioni cellulari specializzate anche dall’azione trofica esercitata da diversi fattori solubili di natura proteica, che agiscono sia in maniera autocrina che paracrina, tra i quali citochine e fattori di crescita. Poiché i podociti e le cellule nervose condividono diverse caratteristiche biologiche, l’espressione di molecole criticamente importanti per la loro funzione e il mantenimento della loro complessa struttura, nonché la stessa origine ontogenetica, il NGF potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella maturazione, nei cambiamenti strutturali e quindi nella funzione delle cellule podocitarie, analogamente a quanto già descritto a livello neuronale. I risultati del presente studio hanno evidenziato, per la prima volta, come i podociti umani immaturi, in corso di differenziamento e completamente differenziati, esprimono costitutivamente il messaggero per il NGF e per i suoi recettori, TrkA e p75NTR. Tale espressione genica è associata, in tutte le condizioni sperimentali, alla produzione, in forma matura, delle proteine recettoriali TrkA e p75NTR ed alla sintesi della neurotrofina in forma biologicamente attiva. L’analisi della distribuzione recettoriale a livello cellulare, condotta mediante microscopia elettronica, ha permesso di evidenziare che l’espressione sub-cellulare di entrambi i recettori varia in funzione dello stadio di maturazione podocitaria, con evidenti differenze nella localizzazione dei recettori ad alta e a bassa affinità, tra podociti proliferanti e podociti maturi. Di notevole interesse è l'evidenza, esclusivamente nella popolazione podocitaria indifferenziata, di una localizzazione di entrambi i recettori per la neurotrofina nel compartimento mitocondriale. L’analisi, mediante studi di immunoprecipitazione, dell'associazione tra i recettori TrkA e p75 e specifiche proteine mitocondriali, quali il traslocatore per il nucleotide adenina (ANT) e la fosfodiesterasi 4 isoforma A5 (PDE4A5), nonché l'evidenza di più elevati livelli di fosfo-ERK1/2 a livello del compartimento mitocondriale dei podociti immaturi rispetto a quelli proliferanti, ha consentito di ipotizzare, per la prima volta, un possibile ruolo del NGF e dei suoi recettori nel controllo dell'omeostasi energetica e nell'induzione di specifici pathways mitocondriali coinvolti nel mantenimento dello stato proliferativo. Gli studi volti a definire il ruolo funzionale del sistema NGF/recettori per il NGF nell’ambito della popolazione cellulare podocitaria hanno inoltre documentato come la deprivazione di NGF (mediante anticorpi anti-NGF), nei podociti immaturi, non ha alcun effetto sul ciclo cellulare, sull'espressione dei recettori per la neurotrofina e sulla loro distribuzione a livello subcellulare, mentre nei podociti in corso di differenziamento, l'esposizione agli anticorpi anti-NGF induce drammatiche alterazioni della morfologia cellulare, con perdita della corretta estensione dei pedicelli e notevole alterazione nell'organizzazione del citoscheletro. Si è anche osservata una riduzione selettiva dei livelli proteici di sinaptopodina, non associata a concomitante diminuzione dei livelli di mRNA, indicando un probabile effetto post-traduzionale della neurotrofina, probabilmente dovuto ad una riduzione dell’attività di fosforilazione della PKA che renderebbe così la sinaptopodina maggiormente esposta al clivaggio da parte della Lcatepsina. E’ noto che il recettore a bassa affinità per il NGF, p75NTR, è coinvolto nel controllo del pathway cAMP/PKA mediante interazione con la PDE4A. Studi di coimmunoprecipitazione del recettore per il NGF p75NTR con la PDE4A su lisati totali di podociti differenziati, di controllo o esposti al trattamento con anticorpi anti-NGF, hanno dimostrato che, nei podociti in corso di maturazione, la deprivazione di NGF induce un aumento dell’interazione p75-PDE4A5, cui consegue una riduzione dei livelli di cAMP e dell’attività della PKA; questo determina infine una maggiore esposizione della sinaptopodina all’attacco da parte della L-catepsina. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che il NGF ha un ruolo chiave nella fisiopatologia del podocita e, considerando l’enorme importanza che la neurotrofina sembra avere nell’ambito del corretto differenziamento podocitario e nel mantenimento della corretta morfologia cellulare, si intravedono possibili prospettive applicative del NGF quale valido strumento terapeutico nel trattamento di patologie renali croniche associate a proteinuria, dal momento che la compromissione della funzione podocitaria ne rappresenta l’evento patogenetico precoce e determinanteItem Different medicinal chemistry approaches towards the identification of novel targets in breast cancer(2013-12-02) Pisano, Assunta; Bartolino, Roberto; Gabriele, Bartolo; Sindona, Giovanni; Maggiolini, MarcelloG protein-coupled receptors (GPCRs) belong to the largest family of cellsurface molecules representing the targets of approximately 40% of current medicinal drugs (Overington, J.P et al 2006). GPCRs are ubiquitous in mammalian (Bockaert, J. et al. 1999), regulate several physiological processes and play an important role in multiple diseases ranging from cardiovascular dysfunction, depression, pain, obesity to cancer (Rosenbaum D.M. et al. 2011). One member of this superfamily, named GPR30/GPER, mediates estrogen signaling in different cell contexts, leading to gene expression changes and relevant biological responses (Filardo E.J et al. 2000, Bologa C.G.et al. 2006, Maggiolini M. and Picard D. 2010). GPER acts by transactivating the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), which thereafter induces the increase of intracellular cyclic AMP (cAMP), calcium mobilization and the activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and the mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (Maggiolini M. and Picard D. 2010). Moreover, the GPER-mediated transduction pathways activated by estrogens trigger the expression of a typical gene signature, including the expression of cfos and the gene encoding the connective tissue growth factor (CTGF), which are involved in the proliferation and migration of diverse cell types (Lappano R. et al 2012a, Madeo A. and Maggiolini M. 2010). On the basis of these findings, the first objective of the present study was the characterization of GPER from different points of view: GPERmediated signaling pathways and biological functions, selective ligands and molecular characterization of the receptors. In particular, the research project focused on:1. the transduction pathways by which the environmental contaminant Bisphenol A (BPA) influences cell proliferation and migration of human breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs); 2. the characterization of novel carbazole derivatives as GPER agonists in ER-negative breast cancer cells; 3. the isolation and characterization of GPER in estrogen-sensitive cancer cells by Mass Spectrometry. Additionally, the second section of this doctoral thesis was focused on the evaluation of the cytotoxic activity of novel synthesized compounds, given the interest and the need to discover new molecules against cancer. In particular, novel titanocene-complexes were studied evaluating their ability to elicit repressive effects on the growth of estrogen-sensitive breast cancer cells.Item Atomic force microscopy study of physico-chemical and nanotribological properties of hydrophobin protein(2009-11-09) Houmadi, M. Said; Giocondo, Michele; Lacaze, EmmanuelleItem Analisi proteomica dell'epicarpo di Limone (Citrus limon [L.] Burm.) Le qualità biochimiche del limone di Rocca Imperiale(2009) Pignataro, Vittorio; Musacchio, Aldo; Mazzuca, SilviaItem Protein characterization from natural matrices by maldi tof-tof(2014-03-13) Aiello, Donatella; Napoli, Anna; Sindona, Giovanni; Gabriele, BartoloItem Caratterizzazione del proteoma di fragola durante la maturazione ed in diversi genotipi(2013-10-24) Bianco,Linda; Musacchio,Aldo; Perrotta,GaetanoItem Stressful and extreme environmental conditions: investigations on organisms from different domains(2013-05-21) Tripepi, Manuela; Musacchio, Aldo