Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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End date: 2009Subject: search.filters.subject.Biologia animale

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    Ruolo del sistema Glutammatergico nella plasticità neuronale amigdalare del Mesocricetus auratus
    (2008) Granata, Teresa; Canonaco, Marcello
    La plasticità sinaptica è un meccanismo neuronale alla base di funzioni complesse del Sistema Nervoso Centrale, come l’apprendimento e la memoria. Tali funzioni sono associate a eventi di potenziamento e depressione sinaptici necessari ad evitare che tutte le sinapsi vadano incontro a saturazione e prevenire cicli di feedback positivo tra l’attività della rete di neuroni e la forza sinaptica. I neuroni di per sé regolano le trasmissioni eccitatorie tramite la variazione del numero e della composizione sinaptica di alcuni sistemi recettoriali come quello glutammatergico. Un ruolo centrale nel controllo della plasticità neuronale è svolto sia dai recettori dell’NMDA che dell’AMPA, costituiti entrambi da diverse subunità recettoriali la cui variazione nella composizione e reciproca organizzazione determina la formazione di recettori con caratteristiche cinetiche e farmacologiche differenti, regolando i processi di plasticità sinaptica sia durante le fasi critiche dello sviluppo encefalico che di particolari stadi fisiologici quali l’ibernazione. In virtù di ciò, il Mesocricetus auratus, un roditore ibernante facoltativo, ha rappresentato un valido modello sperimentale per gli studi neurobiologici condotti in questo lavoro. In un simile contesto, un elemento chiave della regolazione plastica è costituito dal controllo eccitazione-inibizione attraverso fenomeni di cross-talking tra i recettori glutammatergici e quelli GABAergici. In questo lavoro si è evidenziato come l’attivazione di due delle principali subunità recettoriali GABAergiche, quali α1 e α5, abbia determinato un controllo negativo sulle azioni esplicate dagli agonisti glutammatergici, sia nel contesto delle attività di feeding e drinking behavior che dal punto di vista molecolare. Infatti, la subunità α1 si oppone maggiormente alle variazioni nella capacità e/o nella volontà di assumere acqua e cibo, in seguito all’azione dell’NMDA esplicata nell’area di transizione tra l’ipotalamo e l’amigdala, sia in eutermia che in ibernazione; diversamente α5 modula il comportamento alimentare AMPA-dipendente riconducibile all’attività dell’amigdala. E’ stato, inoltre, evidenziato, mediante l’ibridazione in situ, che le maggiori variazioni trascrizionali delle subunità recettoriali glutammatergiche avvengono in seguito alla modulazione per lo più inibitoria esercitata dal sistema GABAergico principalmente attraverso la subunità α5. Questo controllo trascrizionale sarebbe il risultato di meccanismi molecolari atti a modulare l’azione di fenomeni altamente eccitatori attraverso sofisticati processi di feedback negativo: il GABA, ormai inibitorio nell’encefalo adulto, tende a silenziare l’attivazione dei recettori eccitatori, modulando la trascrizione delle loro subunità recettoriali. Un simile meccanismo assume un ruolo funzionale importante nel controllo del ciclo di ibernazione, soprattutto del risveglio, quando potrebbero innescarsi fenomeni eccitotossici simil-ischemici che indurrebbero morte cellulare.
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    L’Angiotensina II modula il calcio intracellulare attivando AT1R, tramite la via di trasduzione dell’IP3 e i canali per il calcio di Tipo T (TCC).
    (2008) Martini, Aurela; Martino, Guglielmo; Canonaco, Marcello
    L’ Angiotensina II è il maggiore effettore del sistema renina-angiotensina. L’Angiotensina I, formata in seguito all’attività enzimatica della renina, interagisce con l’ACE plasmatico e con quello dell’endotelio polmonare convertendosi in Ang II.1 Successivamente l’Ang II è veicolata dal circolo ai suoi organi bersaglio regolando la pressione sanguigna, il bilancio idrico e il tono muscolare. Gli effetti indotti dal peptide sono mediate principalmente da due tipi di recettori di membrana, AT1 e AT2.2 I recettori AT1 stimolano un elevato numero di sistemi di trasduzione del segnale all’interno della cellula, quali fosfolipasi A (PLA), fosfolipasi D (PLD), fosfolipasi C (PLC), le MAP kinasi e la mobilizzazione del calcio intracellulare; infatti è ben nota la modulazione della concentrazione intracellulare di questo ione dall’idrolisi di fosfatidilinositolo-4,5-difosfato. Un’ ulteriore quantità di Ca2+ entra nella cellula anche dall’esterno grazie all’apertura dei canali del calcio. Recenti studi hanno dimostrato l’esistenza dei canali per il calcio di tipo T a livello delle cellule endoteliali, ma il loro vero ruolo non è ancora del tutto chiaro.3 Scopo dello studio: Esaminare il coinvolgimento dell’Ang II nell’incrementare la [Ca2+]i anche attraverso l’attivazione dei canali del calcio di tipo T nelle cellule HUVEC e determinare quale dei due recettori, AT1 o AT2, è coinvolto della attivazione di questi canali. La prima tappa di questo studio è stata la messa a punto del protocollo per la determinazione della vitalità cellulare, mediante l’ Arancio di Acridina, della concentrazione del Calcio, NO e ROS utilizzando rispettivamente le sonde: Fluo-3AM, DAF-2DA e HDCFH-DA. Metodo: Le HUVEC utilizzate al terzo passaggio, sono state mantenute e cresciute in coltura mediante mezzo specifico per cellule endoteliali EGM® Bullet Kit (Lonza) contenente 10% FBS. Le cellule sono state trattate con Ang II alle concentrazioni: 10-9 M o 10-7 M o 10-6 M in presenza o meno degli antagonisti dei recettori AT1 o AT2 per la messa a punto del protocollo. Nel secondo studio le cellule sono state trattate con Ang II alle suddette concentrazioni in presenza degli antagonisti e in presenza o meno dell’ inibitore della via IP3 o del TCC. Le cellule trattate con le sonde sono state osservate dopo 3, 6 e 9 ore. Le immagini sono state catturate col microscopio Olympus utilizzando ProImagePlus 4.0 ed analizzate col programma NIH ImageJ. Risultati: La valutazione dell’effetto dell’Ang II sulla vitalità e sulla modulazione della concentrazione del Calcio, NO e ROS a livello delle cellule endoteliali, ha evidenziato che la concentrazione ottimale per la valutazione degli effetti intracellulare di questo octapeptide nelle cellule endoteliali è 10-7 M; le cellule HUVUC rappresentano un buon modello per valutare l’azione dell’Ang II sull’ endotelio capillare. Il secondo studio ha dimostrato che l’ Ang II induce un alterazione del calcio intracellulare attraverso l’interazione col recettore AT1 stimolando la via IP3 per rapidi effetti fisiologi mentre attiva i canali del calcio di tipo T per tempi maggiori o uguali a 9 ore. Tali risultati suggeriscono che i T-Type Calcium channels regolano direttamente la permeabilità al calcio delle membrane plasmatiche di cellule HUVEC, mediante canali selettivi e non solo tramite la via IP3. Questo risultato mette in risalto il ruolo dei TCC nella regolazione metabolica e strutturale diretta delle cellule endoteliali, accanto a quella delle cellule muscolari lisce dei capillari.
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    Identificazione e caratterizzazione di FoxP nel sistema nervoso centrale di Octopus vulgaris (Mollusca, Cephalopoda)
    (2007) Sirakov, Maria; Tota, Bruno; Borra, Marco; Fiorito, Graziano
    In this study, I searched and was able to identify FoxP in the transcriptome of the cephalopod mollusc Octopus vulgaris, an invertebrate. In addition, I attempted to analyze the expression of Ov-FoxP in the brain of this animal. The results of this analysis are preliminary at this stage. Fox proteins are a set of transcription factors highly conserved in metazoans. They are characterized by a typical DNA binding domain (Forkhead) that, among others, allows to identify 15 different classes of Fox genes. Fox proteins are reported to act as activators/repressors of transcription during both development (including differentiation) and the adult life (e.g. lung, brain, etc.). In vertebrates, FoxP2 (together with FoxP1), in particular, are known to be involved in the development of the neural circuit controlling bird-song and human speech. Our interest for the octopus derives from the fact that this animal, together with other cephalopods, is considered as the most evolved among molluscs. The complexity of the architecture and wiring of the cephalopod nervous system stems from the simpler nervous systems of other taxa belonging to the phylum. In addition, cephalopods show a highly rich behavioral repertoire including the unique capability of changing the appearance of their body (through body patterning) in fractions of seconds and for both mimetic and communicative purposes. Taken all together, these features allow these animals to be considered analogous to higher vertebrates. In the first part of my project, a detailed analysis of the aminoacidic and nucleotidic sequences available for FoxP2 (vertebrates) and FoxP (invertebrates), allowed us to design FoxP in Octopus vulgaris 1 appropriate oligos that were utilized in subsequent PCR experiments to identify the gene of interest in the transcriptome of the brain of O. vulgaris. FoxP resulted in a fragment of 220 bp that corresponded to the Forkhead domain. Further efforts allowed us to identify a 1111bp mRNA sequence of Ov-FoxP corresponding to almost the entire part of the mature mRNA codifying for this protein (the 5’ extremity of the gene results unidentified at this stage). During the second part of my project, I attempted to analyze the expression pattern of Ov- FoxP in the octopus brain using Real Time qPCR and in-situ hybridization. This was carried out with the aim of investigating the possible variability of expression of the gene in different parts of the brain (i.e. supra-, sub-esophageal masses and optic lobes) relative to another tissue (muscular tissue of the mantle) here considered as control. Other genes (16S, tubulin, actin) were also cloned for the aims of this project and their expression was taken as reference; an analysis that is carried out for the first time in O. vulgaris. By Real-Time qPCR I was able to recognize a different pattern of expression in different parts of the brain (N = 10). The data allowed to identify a gradient in the expression levels of FoxP (relative to reference genes) in the subesophageal mass, when the smallest individual of my sample (30 g body weight) was compared with the others (150-2100 g body weight). In situ hybridization (N=6) allowed to localize the expression of FoxP in the lobes of the octopus brain. Ov-FoxP transcripts were identified in neurons of: i. the optic lobes (several sparse cells possibly related with visual input processing); ii. the superior buccal and the lateral part of the basal lobes (high-order motor centers of the supraesophageal mass), and iii. the pedal tracts and anterior and posterior chromatophore lobes (subesophageal mass). FoxP in Octopus vulgaris 2 An elevated number of cells was revealed through in-situ hybridization in the last two lobes. It is noteworthy to mention that these structures are known to play a key role in the neural control of the chromatic expression of the skin of O. vulgaris (and other cephalopods): namely the animal’s body pattern. Our data seems to suggest that Ov-FoxP is expressed during different phases of the life of the octopus. In addition the localized expression in definite lobes and the variability among individuals of its expression in the same brain parts allows us to formulate the working hypothesis of the role of Ov-FoxP in the plasticity and/or maintainance of neural networks. My project in O. vulgaris confirms similar results deduced from other studies in both invertebrates (i.e. motor neurons in C. elegans) and vertebrates (i.e. song-birds, mouse, etc).