Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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Arm growth and regeneration in octopus (Octopus vulgaris and Eledone moschata)
(Università della Calabria, 2020-02-12) Baldascino, Elena; Cerra, Maria Carmela; Fiorito, Graziano
Here I evaluated the timing and rate of arm regeneration in octopus, a cephalopod mollusc, and contributed to the understanding of the molecular machinery involved in arm growth and regeneration in two octopus’ species: Octopus vulgaris and Eledone moschata. This work stands and revisit in part the first experimental study on arm regeneration in cephalopod molluscs, including the two species carried out by M. Lange (1920). An arm of octopus may fully regenerate and regrowth in few months after amputation. Lange recognized three stages: wound healing, tissue degeneration and tissue renewal. I applied the 3Rs principle to this study utilizing samples and data from a previous study, thus limiting the number or live animals humanely killed for the purpose of this PhD project. During the analysis of data, I found the same three stages in O. vulgaris arm regeneration to occur. I was not able to observe similar series of events in E. moschata, probably due to limited time and conditions of the animals. I found that O. vulgaris increased significantly body weight in 21 weeks. The growth appeared to be affected by repeated anesthesia, thus encouraging further studies on the physiological responses to stress in octopus. Data I analyzed confirm the view that O. vulgaris is characterized by rapid non-asymptotic growth, with high individual variability. Octopuses elongate their arms continuing to grow over time with no significant difference in the relative rate of elongation between anterior and posterior arms. The arms that underwent to regeneration, appear to have a faster growth when compared with the contralateral arms (but repeated anesthesia influenced the rate of growth of regenerating arms). Data analyzed extent the study of Lange, by providing morphometric information on the relative growth rate of the arms (regenerating vs contralateral), for the first time. A significant change in the relative expression profile of the tip vs the proximal part of the arm in O. vulgaris was observed using different approaches, confirming and extending the view that the tip the arm represents an exceptional biological system where continuous growth is achieved through massive cellular differentiation and interesting molecular events. I identified 39 genes in O. vulgaris and seven in E. moschata and studied their involvement in arm growth and/or regeneration events in octopus arms. These studies are novel.
Livelli fisiologici della Cromogranina A esercitano potente effetto cardioprotettivo contro la cardiotossicità indotta da doxorubicina
(Università della Calabria, 2020-02-14) Granieri, Maria Concetta; Pasqua, Teresa; Angelone, Tommaso
The clinical use of doxorubicin (Doxo), a widely used anticancer chemotherapeutic drug, is limited by dose-dependent cardiotoxicity. We have investigated whether chromogranin A (CgA), a cardioregulatory protein released in the blood by the neuroendocrine system and by the heart itself, may contribute to the regulation of cardiotoxic and antitumor activities of Doxo. We evaluated whether and to which extent, the in vivo administration of physiological doses of recombinant full-length CgA may exert cardioprotection in a Doxo-induced cardiotoxicity rat model and modulate the anticancer activity of Doxo in murine models of melanoma, fibrosarcoma, lymphoma, and lung cancer, respectively. The effect of Doxo on circulating levels of CgA was also investigated. At the end of the treatment, hearts were perfused by Langendorff method and Ischemic protocols were used. Western Blot, Immunohistochemistry techniques, and ELISA assay were used for molecular analysis and plasma measurements of TNFα, IL-1β, ROS, LDH, cTnT and CgA. We found that CgA mitigated Doxo-dependent adverse effects, as revealed by the reduction of pro-inflammatory and cardiotoxic markers. Doxo reduced CgA plasma levels. When given together with Doxo, CgA increased the systolic function after ischemia and reduced the infarct size, compared to the Doxo group alone. Molecular analysis indicated that CgA reduced CTGF expression, induced activation of the RISK and SAFE pathways and of AMPK, and reduced inflammatory targets such as iNOS, COX2, NLRP3. CgA reduced intracardiac ROS and the expression of AOX-1 and XO. CgA-dependent cardioprotection was mediated by ARC activation, by the increase of Bcl2 and the reduction of BAX, Caspase3 and the apoptotic nuclei. Furthermore, we observed that Doxo reduces the intracardiac expression and release of CgA (i.e., an important cardioprotective agent) in the blood. On the other hand, CgA did not impair the anticancer activity of Doxo in all the investigated murine models. These data suggest that CgA could mitigate Doxo-induced cardiotoxicity by limiting ischemic injury. The protein can be proposed as a possible biomarker and the administration of exogenous CgA to patients with low levels of the endogenous protein might represent a novel approach to prevent Doxo-induced adverse events without impairing its antitumor effects.
Design and biological evaluation of new anticancer agents vehicled in innovative pharmaceutical matrices
(Università della Calabria, 2020-02-25) Ceramella, Jessica; Cerra, Maria Carmela; Gabriele, Domenico; Sinicropi, Maria Stefania
Tra tutti i tumori, quello al seno e all’utero rappresentano la principale causa di morte nelle donne. Una grande sfida è oggi rappresentata dallo sviluppo di agenti nuovi e più efficaci in grado di possedere buona attività antitumorale, evitando l’insorgenza di effetti collaterali e di fenomeni di resistenza. In questo ambito, l’attività svolta durante il dottorato di ricerca ha riguardato lo studio delle proprietà antitumorali di nuove molecole di sintesi, quali analoghi di noti antitumorali. In particolare, la ricerca ha evidenziato gli interessanti effetti antiproliferativi su diverse linee cellulari di tumore al seno a all’utero di composti a struttura carbazolica, analoghi dei farmaci noti Ellipticina e Vinblastina. Molti di questi composti sono stati in grado di indurre morte cellulare per apoptosi nelle cellule tumorali, per inibizione delle topoisomerasi e/o della polimerizzazione della tubulina. Una promettente attività multi-target si è anche ottenuta con complessi metallici dell’oro a nucleo carbenico, analoghi del Cisplatino, molecole di grande interesse e che, pertanto, potrebbero rappresentare validi candidati per lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali. Considerando poi che negli ultimi anni il riutilizzo di farmaci già noti, in grado di agire su nuovi target, risulta di notevole interesse scientifico, in quanto ciò consente di ridurre gli sforzi della ricerca sia in termini pratici che economici, si è pensato di valutare l’attività antitumorale esercitata da alcuni analoghi sintetici della Talidomide. È risultato che essi sono stati capaci di indurre apoptosi interferendo con i processi di metastatizzazione e di angiogenesi. Ulteriori investigazioni hanno riguardato lo studio di molecole di origine naturale ed in particolare le proprietà biologiche della Quercetina e di suoi analoghi. Alcuni di essi hanno mostrato, oltre ad una marcata attività antitumorale sulla linea metastatica di breast cancer MDA-MB-231, anche una duplice azione, in quanto abili a proteggere le cellule sane dallo stress ossidativo ed anche ad indurre produzione di specie reattive dell’ossigeno, con conseguente morte cellulare nelle cellule tumorali. Inoltre, sono state realizzate e studiate alcune formulazioni per farmaci noti quali il Sunitinib, la Quercetina e il Cisplatino, che hanno permesso di ottenere molecole con profili farmaceutici migliorati, in termini di solubilità, tossicità, stabilità e rilascio. È noto, infatti, che lo sviluppo di nuovi agenti è molto dispendioso in termini di tempo e denaro, perciò oggigiorno il miglioramento della sicurezza e dell’efficacia di farmaci noti attraverso il drug delivery sta diventando un’alternativa “smart”, soprattutto in campo oncologico. I promettenti risultati ottenuti durante la ricerca, considerato che le varie molecole studiate sono state preparate con vie sintetiche semplici, che molte di esse hanno mostrato una buona attività antitumorale con assenza di citotossicità sulle cellule sane e che hanno coinvolto importanti target biologici, studi futuri verteranno sull’approfondimento delle loro proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche grazie a studi pre-clinici. Ciò consentirà di aprire nuove ed interessanti prospettive per lo sviluppo e l’impiego di questi “tools” in oncologia.
Monitoraggio di un gruppo di insetti predatori, i coleotteri carabidi, ai fini della conservazione e dello sviluppo sostenibile dell'agricoltura nel parco nazionale della Sila
(Università della Calabria, 2020-02-13) Cavaliere, Francesco; Cerra, Maria Carmela; Brandmayr, Pietro; Giglio, Anita
Agricultural management practices are known to cause lethal and sub-lethal effects on animals inhabiting croplands. The persistence and residual accumulation of pesticides in the soil are detrimental to the environment and pose a risk for human health and for species providing biocontrol ecosystem services. Carabid beetles are useful bioindicators to evaluate the ecological effects of agrochemicals due to their ecological role as predators in farmland. In order to assess the sub-lethal effects at the community, species and organism levels, on non-target species caused by regular pesticide applications, an environmental monitoring was performed over a period of two years, in two sites around the agricultural area to Sila National Park. One site is a conventional farm (39°16'58.05"N, 16°38'43.26"E, 1240 m a.s.l., Torre Garga Farm, Calabria, Italy), it was treated with herbicides, pesticides and fungicides used for pest control. The second site, chosen as control, is an organic farm (39°17'10.28"N, 16°42'28.33"E, 1150 m a.s.l., Macchia di Tuono Farm, Calabria, Italy). To check the direct sublethal effect of field exposure on species abundance and density at the community level, carabid beetles were collected in vivo by pitfall traps and identified using dichotomous keys. To asses the direct sub-lethal effect of field exposure at the organism level, the body size, the constitutive immune responses and genotoxicity we quantified in adults of Harpalus rufipes, a generalist predator taxonomically and ecologically well known, widely distributed and easy to collect in crops. The findings of this study indicated that chemical treatments admitted in the conventionally managed fields have negative effects on the abundance and density of species inhabiting croplands, the low level of PO and lysozyme-like enzyme activities and the DNA damage recorded in haemocytes indicated that field treatments might influence this non-target soil-dwelling species. However, field treatments did not cause morphometric changes in the body size of adults. The reduction of humoral responses and the genotoxic effect recorded on haemocytes may result in an increased susceptibility of this species to pathogens. From an ecoimmunological point of view, a modification of other basic life history traits such as reproduction, dispersal activity and predation may occur with effects on the adult fitness, resulting in changes of the population structure and in a reduction of the biocontrol activity for pest species in agroecosystem.
Molecular mechanisms involved in the regulation of certain miRNAs in breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts
(Università della Calabria, 2020-02-03) Sebastiani, Anna; Maggiolinu, Marcello; Cerra, Maria Carmela
MicroRNAs (miRNAs) are non-coding small RNA molecules that regulate gene expression by inhibiting the translation of target mRNAs. It has been well demonstrated that miRNAs play a regulatory role in different pathophysiological conditions, including breast cancer. In this regard, a distinct miRNA may be up regulated in certain malignancies and downregulated in others, suggesting both an oncogenic and tumor suppressor role, respectively. It has also reported that in breast cancer estrogens may regulate miRNA expression through the involvement of the classic estrogen receptor (ER) alpha and the G protein coupled receptor, GPER. By using RT-PCR and western blotting assays, as well as by gene silencing approaches, in the present work we provide novel insights on the involvement of miRNAs in the breast tumor progression. In particular, we ascertained that miR-221 expression is up-regulated in breast cancer cells SkBr3 and MDA-MB 231 and in cancer-associated fibroblasts (CAFs). In addition, we found that the proliferative and migratory effects induced by miR-221 in these cell types are mediated by interfering the A20/c-Rel/CTGF pathway. These stimulatory effects are abolished silencing the expression of the NF-κB component, c-Rel and the Connective Tissue Growth Factor (CTGF), as well as using the specific Locked Nucleic Acid (LNA)-Inhibitor of miR-221 (LNA-i-miR-221). In a second work, we evaluated the expression of 754 miRNAs by TaqMan Array in ER-negative and GPER-positive SkBr3 breast cancer cells and in CAFs upon 17-β-estradiol (E2) treatment. Among the miRNAs down-regulated by 100nM E2 for 4 hours in these cell types, we identified miR-338-3p that is positively correlated with overall survival in breast cancer patients as ascertained by METABRIC database analysis. According to these data, a miR-338-3p mimic sequence decreased and a miR-338-3p inhibitor sequence rescued the proliferative effects and cell progression induced by 100nM E2 and G-1, selective ligand of GPER in SkBr3 breast cancer cells and CAFs. Overall, these results provide new insights on the miRNA action in breast cancer, suggesting their use as an innovative therapeutic approach in this malignancy.
Learning and memory in Octopus vulgaris: search of the underlying biological machinery
(Università della Calabria, 2021-03-01) Manzo, Paolo; Cerra, Maria Carmela; Fiorito, Graziano
The cephalopod mollusc Octopus vulgaris is known for the richness of behavioral repertoire, neural and behavioral plasticity, and complex cognition rivaling higher Vertebrates. Animals are known to learn over a variety of tasks, equipped with different sensory-motor systems, i.e. visual and tactile, and able to recall the outcomes of their experience for long term (e.g., ‘one month’ Sutherland, 1957; ‘some months’ Sanders, 1970). In the present study, a fear conditioning training protocol was adopted to evaluate O. vulgaris behavioral responses to an artificial stimulus to be avoided. Behavioral outcomes have been tested for the effect of a protein synthesis inhibitor on memory acquisition and retention, and for changes in the pattern of expression of genes potentially involved in memory formation. Applying the 3Rs principle, I used samples from a previous study, thus limiting the number or live animals humanely killed for the aims of this PhD project. My experiments and analysis allowed to: i. Identify that cycloheximide-induced protein synthesis inhibition did not alter the octopus ability to acquire an avoidance learning task. However, octopuses ability to retain and recall the memory was impaired; ii. Data available to me did not allow to rule out a state-dependent effect of cycloheximide injection that somehow affects memory recall and octopuses ability to learn; iii. Identify 24 target genes, nine memory-related genes and 15 epigenetic modifiers, from O. vulgaris transcriptome, and studied their gene expression profile in relation with learning and memory consolidation.
Sviluppo di un processo integrato per il recupero energetico e di composti valorizzabili da residui organici
(Università della Calabria, 2020-04-16) Limonti, Carlo; Calabrò, Vincenzo; Siciliano, Alessio; Cerra, Maria Carmela
La ricerca di nuove fonti energetiche e la crescente consapevolezza sulla salvaguardia ambientale rappresentano i punti cardine per lo sviluppo di un’economia sostenibile a livello globale. In quest’ottica, l’attenzione della comunità scientifica è sempre più rivolta alla definizione di vere e proprie bioraffinerie finalizzate alla conversione degli scarti organici in biocarburanti e in sottoprodotti ad alto valore aggiunto. In tal senso, il presente lavoro di tesi ha avuto come obiettivo lo sviluppo un innovativo processo integrato attraverso il quale, da una data biomassa di scarto, si possano generare biocombustibili e fertilizzanti a lento rilascio Nello specifico, il trattamento integrato oggetto del presente studio ha previsto un primo processo di digestione anaerobica, a valle della quale si è previsto un processo di gassificazione idrotermica in condizioni supercritiche per l’upgrading del digestato ed un ultimo trattamento di recupero di composti nutrienti dalla frazione liquida in uscita dalla gassificazione. Lo studio della digestione anaerobica è stato indirizzato alla produzione di biogas ad alto contenuto di metano. Con la gassificazione idrotermica in condizioni supercritiche, si è inteso sfruttare il digestato in uscita dalla digestione per la produzione di syngas. Infine, mediante il processo di precipitazione della struvite, si è inteso produrre, dalla fase liquida residua della gassificazione, un fertilizzante a lento rilascio a base di fosforo, potassio e magnesio. Nello specifico, le sperimentazioni sono state suddivise in due fasi tra di loro interconnesse. In particolare nella prima fase (FASE-1) si è condotto uno studio sulla digestione anaerobica sia in modalità batch che modalità semicontinua. I test in batch sono stati condotti su biomasse residuali agroindustriali e FORSU. Per quanto riguarda le prime, si è evidenziata la necessità di miscelare efficacemente le diverse biomasse da avviare a co-digestione in modo da creare Mix idonei al processo in grado di ottenere rese di produzione soddisfacenti. In particolare, dei due Mix avviati a digestione, quello caratterizzato da un elevato valore iniziale del rapporto iniziale di VFA/Alcalinità ha avuto performance di produzione di biogas inferiori. L’altro, invece, con caratteristiche maggiormente equilibrate, ha fatto registrare ottime produzioni di biogas con una resa specifica pari a 0.44 Lbiogas/gCODrimosso e percentuali di CH4 del 74%. Mentre, dai test condotti con la FORSU, è emersa la necessità di effettuare un innovativo pretrattamento ossidativo tale da migliorare alcune caratteristiche intrinseche della matrice, in modo da favorire migliori rese di produzione di biogas. Il processo ha, infatti, permesso il miglioramento della biodegradabilità della matrice non riducendo eccessivamente il carico organico di partenza e favorendo al contempo l’incremento degli acidi grassi volatili. I test in semicontinuo sono stati condotti in tre RUN di sperimentazioni successivi utilizzando un impianto completamente miscelato (CSTR), interamente progettato e costruito in laboratorio. Dalle attività sperimentali condotte nel RUN-1, finalizzate allo studio del processo di digestione anaerobica al variare dei principali parametri operativi, è emerso che le migliori performance di processo possono essere raggiunte alimentando il reattore con un carico organico volumetrico di 24.5 kgCOD/m3d, con rese specifiche in CH4 di circa 0.36 NLCH4/gCODrimosso e percentuali di produzione in metano superiori al 70%. Nei test condotti nel RUN-2, il monitoraggio in continuo delle produzioni di biogas ha consentito di individuare le velocità di produzione e, conseguentemente, le velocità di consumo del substrato. Dall’analisi di quest’ultime curve, è emerso che per bassi carichi organici applicati non si raggiungono le condizioni di saturazione, mentre, alimentando il reattore con un carico organico volumetrico di 16 e 20 kgCOD/m3d, le velocità di rimozione si attestano a valori di circa 1.2 e 1.4 gCOD/Lh, rispettivamente. Successivamente, note le curve sperimentali di rimozione del substrato al variare del carico volumetrico applicato è stato possibile modellare matematicamente il processo anaerobico secondo i modelli di Monod e di Haldane, definendone i parametri cinetici. In particolare, le modellazioni effettuate secondo il modello di Monod, hanno mostrato un buon fitting dei dati sperimentali considerando i carichi organici volumetrici fino a 16 kgCOD/m3d, con valori dei parametri cinetici di μm variabili da 0.5768 gCOD./Lh, per il carico organico di 4 kgCOD/m3d, fino al valore di 1.773 gCOD./Lh, per il carico organico volumetrico di 16 kgCOD/m3d. Le modellazioni effettuate considerando il modello di Haldane hanno evidenziato un fitting dei dati sperimentali migliorato principalmente per quanto riguarda i carichi organici volumetrici di 20 e 30 kgCOD/m3d. Infine, i risultati del RUN-3 hanno dimostrato come la produzione di biogas si riduce all’aumentare della pressione di esercizio del reattore. Tuttavia, l’incremento di pressione ha determinato la produzione di un biogas con un più elevato tenore in CH4 rispetto al normale processo condotto a pressione atmosferica. In particolare, si sono registrate produzioni di CH4 comprese tra il 72 ed il 76%. Nella seconda fase (FASE-2) delle sperimentazioni sono stati condotti i test relativi alle altre due tecnologie che costituiscono il sistema integrato proposto: la gassificazione supercritica idrotermica ed il recupero dei nutrienti. I risultati ottenuti dalla gassificazione idrotermica dei digestati hanno dimostrato l’effettiva applicabilità del processo. Inoltre, le rese di gassificazione si sono rivelate migliori nei digestati caratterizzati da un carico organico maggiore con rese in gas nell’ordine di 1.8 molsyngas/kgTS. Infine, i test di precipitazione condotti sulle frazioni liquide in uscita dalla gassificazione idrotermica supercritica hanno dimostrato la possibilità di recuperare efficacemente il fosforo disciolto. Le migliori condizioni di processo sono state identificate con un valore di pH=10 e con un rapporto molare Mg/P pari a 1. In tali condizioni, le rese di recupero del fosforo sono risultate superiori al 90%. Dai risultati ottenuti, dunque, possiamo affermare che il sistema integrato proposto costituisce un valido processo tecnologico per il recupero sostenibile di materia e di energia.
Sviluppo di una nuova applicazione GIS open-source per la stima della produzione di sedimenti e del trasporto solido a scala di bacino idrografico
(Università della Calabria, 2020-04-16) La Rosa, Salvatore; Critelli, Salvatore; De Rosa, Rosanna; Dominici, Rocco
Facies analysis and fluid inclusion studies of the Messinian evaporites, Calabria, Southern Italy
(Università della Calabria, 2020-03-26) Cipriani, Mara; Critelli, Salvatore; Costanzo, Alessandra; Dominici, Rocco
Messinian salinity crisis (MSC) is, from about 30 years, one of the most important and debated topic in the scientific community, both in environment and economic field. In this context, Calabrian evaporite deposits, poorly investigated in the past, offer an interesting opportunity to expand the knowledge because they confirm and increase the models created for other Mediterranean basins, and add important information on the main halite and gypsum facies. In this regard, saline evaporitic facies outcropping in the Crotone, Catanzaro and Ionic Basins were investigated using a multidisciplinary approach from classical petrography, to the study of fluid inclusions (FIs) to isotopic geochemistry. (A) The halite samples from the Crotone Basin have highlighted three primary facies; two known in the literature as banded and white while the third, never observed before, called in this work transparent. The transparent facies seems recrystallized but the analyses conducted show instead a primary origin. The three facies form in different environment and with a dissimilar deposition rate (fast or slow) due to pycnocline oscillation (daily or seasonal). Pycnocline oscillations can explain the different temperature of homogenization found within the FIs (from +20° to +33°C). The facies form in a hybrid brine (salinity av. ̴ 26.2 eq. wt% NaCl) enriched in Ca-Mg-Na-K-Cl elements, regardless of their deposition rates. During their fluid inclusions testifying plastic and ductile deformations that don’t remove primary features, demonstrating low recrystallization during burial process. Moreover, isotopic data attribute these facies at the second step of the MSC (5.6-5.5 Ma) during Halite deposition stage in the Mediterranean Basin. (B) The selenite samples from the Catanzaro Trough belong to banded and giant facies. The crystals record middle-frequency climatic oscillation between the depositional cycles and high-frequency climatic oscillation (seasonal) between cloudy and clear microfacies observed within the crystals. These microfacies testify a different brine condition associated with seasonal variation: cloudy intervals form during continental water inflow in the humid phase (Mg and Ca as dominant elements and low salinity values - av. ̴ 3 eq. wt% NaCl), while, clear intervals form in marine water during the arid phase (Na, K and Cl as dominant elements and high salinity values - av. ̴ 21.5 eq. wt% NaCl). Isotopic data attribute these facies at the third step of the MSC (5.5-5.3 Ma) placing, for the first time, the formation of the giant facies at the Upper Gypsum stage in the Mediterranean Basin. (C) The analyses conducted on the gypsum deposit from the Ionian Basin have shown that these crystals do not display primary features. This deposit is an olistostrome. The isotopic data confirm secondary origin attributing these facies at the second step of the MSC (5.5-5.3 Ma) during the Resedimented Lower Gypsum deposition stage in the Mediterranean Basin. The data obtained from the study of the Calabrian Messinian deposits indicate a surprising variety and diversity of evaporitic facies. In this work, it emerges that the formation of, crystals trap primary FIs and microalgae (blue, green and yellow). Primary FIs and organic matters, associated with secondary the different facies is strongly conditioned by climate (wet/arid) and intrinsic characteristics of the basin (depth, arrival of continental water flows etc.) which promote the development of one facies rather than of another.
Arm growth and regeneration in octopus (Octopus vulgaris and Eledone moschata)
(Università della Calabria, 2020-02-07) Baldascino, Elena; Cerra, Carmela; Fiorito, Graziano

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