Tesi di Dottorato

The cephalopod mollusc Octopus vulgaris is known for the richness of behavioral repertoire, neural and behavioral plasticity, and complex cognition rivaling higher Vertebrates. Animals are known to learn over a variety of tasks, equipped with different sensory-motor systems, i.e. visual and tactile, and able to recall the outcomes of their experience for long term (e.g., ‘one month’ Sutherland, 1957; ‘some months’ Sanders, 1970). In the present study, a fear conditioning training protocol was adopted to evaluate O. vulgaris behavioral responses to an artificial stimulus to be avoided. Behavioral outcomes have been tested for the effect of a protein synthesis inhibitor on memory acquisition and retention, and for changes in the pattern of expression of genes potentially involved in memory formation. Applying the 3Rs principle, I used samples from a previous study, thus limiting the number or live animals humanely killed for the aims of this PhD project. My experiments and analysis allowed to: i. Identify that cycloheximide-induced protein synthesis inhibition did not alter the octopus ability to acquire an avoidance learning task. However, octopuses ability to retain and recall the memory was impaired; ii. Data available to me did not allow to rule out a state-dependent effect of cycloheximide injection that somehow affects memory recall and octopuses ability to learn; iii. Identify 24 target genes, nine memory-related genes and 15 epigenetic modifiers, from O. vulgaris transcriptome, and studied their gene expression profile in relation with learning and memory consolidation.

Il cloruro di magnesio (MgCl2) rappresenta l'anestetico più comunemente utilizzato per i cefalopodi; tuttavia, i suoi effetti fisiologici compresi quelli a livello cardiaco non sono ben caratterizzati. Nel presente studio, utilizzando come modello sperimentale il polpo comune Octopus vulgaris, è stato valutato mediante la tecnica del cuore isolato e perfuso: a) se l'esposizione dell’animale in vivo (immersione) a diverse formulazioni di MgCl2 induce effetti sulla funzione cardiaca in vitro che potrebbero danneggiare il recupero dall'anestesia; b) l’effetto diretto della perfusione con diverse formulazioni di MgCl2 sulla funzione cardiaca. Per gli esperimenti in vivo, sono state utilizzate le seguenti formulazioni con relativi tempi di esposizione: i) MgCl2 3,5% in acqua di mare (MgCl2 sw, 20min); ii) MgCl2 3,5% (1:1, acqua di mare:acqua distillata, 20min); miscela di MgCl2 (1,12%) + etanolo (1%) (Mix, 20min e 45min); ipotermia (4°C, 5-10min). Alle condizioni basali, i cuori prelevati dopo esposizione ai vari trattamenti anestetici, inclusa l’ipotermia, sono stati in grado di lavorare con carichi emodinamici simili a quelli in vivo e di produrre valori fisiologici di gittata sistolica. In condizioni di carico emodinamico (incrementi di precarico), i cuori rimossi da animali esposti in vivo ad MgCl2 sw (20min) o al Mix (20min) hanno mostrato una performance cardiaca (in termini di risposta di Frank-Starling) comparabile a quella di animali anestetizzati mediante ipotermia. Al contrario, sia l'esposizione a MgCl2 (1:1, 20min), che al Mix (45min) ha mostrato un significativo deterioramento della risposta di Frank-Starling in termini di ridotta capacità di rispondere agli incrementi di precarico. Dopo esposizione ad ipotermia, la perfusione dei cuori isolati con concentrazioni crescenti delle diverse formulazioni di MgCl2, ha prodotto un effetto bradicardico dose-dipendente (e in alcuni casi arresto cardiaco) ed una riduzione della gittata cardiaca e del volume sistolico, indicativi di un effetto diretto dei trattamenti anestetici sul cuore. Al contrario, la perfusione con dosi crescenti di solo etanolo non ha causato alcuna variazione della frequenza cardiaca, indicando che l’effetto bradicardico evidenziato con la soluzione Mix è attribuibile al cloruro di magnesio. L'espressione di HSP70 e caspasi-3, e la fosforilazione di JNK e p38MAPK sono stati determinati in omogenati cardiaci, ottenuti da esemplari di O. vulgaris esposti alle diverse formulazioni di cloruro di magnesio o ad ipotermia (4°C). I risultati hanno evidenziato un incremento dell’espressione di HSP70 (ma non della caspasi-3); in particolare, l’espressione di HSP70 è risultata essere inferiore nei cuori prelevati da animali esposti ad ipotermia, rispetto a quelli esposti alle diverse formulazioni di MgCl2. Tra questi ultimi, nessuna differenza quantitativa è stata evidenziata tra le diverse formulazioni, ad eccezione del Mix 45min, effetto dovuto probabilmente al maggior tempo di esposizione. L'aumento della fosforilazione di JNK e p38MAPK, parallelo all'aumentata espressione di HSP70, lascia supporre il coinvolgimento di queste MAPKs nell'espressione di HSP70. Nell'insieme i dati dimostrano che, a condizione che l'esposizione in vivo al 3,5% di MgCl2 in acqua di mare o ad una miscela di MgCl2+etanolo sia limitato a ~ 20min, gli effetti residui sulla funzione cardiaca non influenzano il recupero post-anestesia. Inoltre, l’espressione di HSP70 che può giocare un ruolo citoprotettivo nella risposta allo stress durante l'anestesia, parallela alla mancata espressione della caspasi-3 in tutti i tessuti analizzati, permette di escludere eventi pro-apoptotici da parte di tutti i trattamenti anestetici. Nell’insieme questi risultati possono contribuire alla discussione circa le pratiche anestesiologiche da utilizzare anche in relazione all'applicazione della nuova Direttiva 2010/63 / UE per i cefalopodi.

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