Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione dell'Università della Calabria.

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Action of the E2/ERβ/PTEN signaling in the metabolic reprogramming of TCam 2, human melanoma cell line
(2019-03-21) De Rose, Daniela; Andò, Sebastiano; Aquila, Saveria
I tumori maligni più abbondanti nella popolazione maschile di età compresa tra i 17 ed i 45 anni, sono i tumori delle cellule germinali (GCTs). Essi comprendono un gruppo eterogeneo di neoplasie in termini istologici, di marker d’espressione ed età di manifestazione. I tumori delle cellule germinali testicolari negli adolescenti e negli adulti (TGCTs) possono essere classificati in tumori seminomatosi (GCT di tipo II) e non seminomatosi. Nel nostro studio prenderemo in considerazione il GCT di tipo II, utilizzando come modello sperimentale la linea cellulare TCam2, ad oggi unica al mondo ampiamente caratterizzata e comprendente tutte le caratteristiche del seminoma umano, originata dalla lesione primaria di un seminoma testicolare sinistro di un paziente di 35 anni. La difficoltà di avere un modello cellulare valido per i tumori seminomatosi è il motivo principale che rende il tumore testicolare uno dei tumori meno studiati. La ricerca sul cancro testicolare continua ad investigare e studiare terapie volte ad indurre la morte nelle cellule tumorali. Recentemente, il metabolismo energetico è considerato un obiettivo innovativo nelle terapie antitumorali, in quanto le alterazioni metaboliche sono una caratteristica comune dei tessuti cancerosi. Il fenotipo metabolico maggiormente caratterizzante e per prima osservato nelle cellule cancerose è quello conosciuto come Effetto Warburg, che prevede la produzione di ATP attraverso la glicolisi invece che attraverso la fosforilazione ossidativa, anche in presenza di normali concentrazioni di ossigeno (Barger JF et al. 2010). Tuttavia, la riprogrammazione metabolica nei tumori si estende oltre l'Effetto Warburg. In effetti, la teoria classica sul metabolismo delle cellule tumorali (aumento dell'attività glicolitica e down-regolazione della fosforilazione ossidativa) è ancora oggetto di indagini in quanto numerosi studi hanno dimostrato che le cellule tumorali possono vivere in un ampio spettro di stati bioenergetici che variano dalla predominanza del fenotipo glicolitico, glicolitico parzialmente ossidativo, fino a quello prevalentemente fosforilativo (Smolková K et al. 2011). Gli estrogeni ed i loro recettori, sono in grado di modulare diversi aspetti del metabolismo cellulare come quello glucidico o lipidico, un’alterazione dei loro pathways trasduzionali è stata correlata infatti allo sviluppo di malattie metaboliche (Faulds Malin Hedengran, 2012). Nel nostro precedente studio abbiamo evidenziato un link tra ERβ/PTEN che attivato dall’estradiolo, induce la morte di tali cellule mediante autofagia e necroptosi (Guido C. et al. 2012). Poiché, morte cellulare e metabolismo energetico sono strettamente correlati, abbiamo ipotizzato che il link E2/ERβ/PTEN possa indurre una alterazione anche nella riprogrammazione metabolica nelle cellule di SE. Il ruolo di PTEN nella sopravvivenza e proliferazione cellulare è stato già riportato, inoltre PTEN è in grado di influenzare alcuni pathways metabolici come il metabolismo del glucosio (Madeline B, 2002), ed il metabolismo lipidico (Qiu W. 2008; Juan Liu, 2012; Ana Ortega-Molina and Manuel Serrano, 2013). Lo scopo di questo studio è quello di investigare un potenziale cross-talk funzionale tra E2, ERβ e PTEN nell’interferire sulla riprogrammazione metabolica delle cellule TCam2 di seminoma umano, così da ampliare le nostre conoscenze sul ruolo e sulla regolazione del gene PTEN oltre che sulla biologia di questo tipo di tumore. I nostri dati evidenziano un nuovo ruolo dell’ERβ come tumor suppressor, indicando che il meccanismo attraverso cui l’E2 induce la morte delle cellule TCam2 avviene anche attraverso l’alterazione della riprogrammazione metabolica in cooperazione con il gene PTEN. Ad oggi, il metabolismo di questa linea cellulare non è stato ancora investigato e pertanto il nostro lavoro contribuirà a migliorare le conoscenze su questo aspetto della biologia del seminoma umano. Concludendo, i nostri risultati supportano l’idea di una dipendenza estrogenica del tumore testicolare come già riportato in letteratura, indicando l’ERβ come possibile target terapeutico per il trattamento di questa condizione patologica.
Activated FXR inhibits leptin signaling and counteracts tumor-promoting activities of cancer-associated fibroblasts in breast malignancy
(2017-06-12) Vircillo, Valentina; Andò, Sebastiano; Catalano, Stefania
Cancer-associated fibroblasts (CAFs), the principal components of the tumor stroma, play a central role in cancer development and progression. As an important regulator of the crosstalk between breast cancer cells and CAFs, the cytokine leptin has been associated to breast carcinogenesis. The nuclear Farnesoid X Receptor-(FXR) seems to exert an oncosuppressive role in different tumors, including breast cancer. In this study, we demonstrated, for the first time, that the synthetic FXR agonist GW4064, inhibiting leptin signaling, affects the tumor-promoting activities of CAFs in breast malignancy. GW4064 inhibited growth, motility and invasiveness induced by leptin as well as by CAF-conditioned media in different breast cancer cell lines. These effects rely on the ability of activated FXR to increase the expression of the suppressor of the cytokine signaling 3 (SOCS3) leading to inhibition of leptin-activated signaling and downregulation of leptin-target genes. We further extend our data investigating whether FXR agonist may directly influence CAF phenotype. We demonstrated that FXR is expressed in different CAFs and treatment with GW 4064 is able to induce the transcription of key FXR target genes, including SHP (Small Heterodimer Partner) and BSEP (Bile Salt Export Pump). Interestingly, FXR activation is able to significantly reduce CAF motility, without influencing their proliferation capabilities. Accordingly, IPA (Ingenuity Pathway Analysis) on FXR-modulated genes highlighted cellular movement as the most significantly represented biologic process and evidenced a marked reduction in the activity of Rho signaling and Integrin proteins, with activation z-score of -1, -0,5 respectively. Moreover, our data showed a reduction in stress fibers formation in GW 4064 -treated CAFs. Activated FXR is able to reduce tumor promoting effects of CAFs on breast cancer cells, due to the ability of GW 4064 to reduce CAF secreted soluble factors, including IGF-1 (Insulin Growth Factor-1), FGF-9 (Fibroblast Growth Factor 9), TGF-3 (Transforming Growth Factor Beta 3) and others key mediators involved in the crosstalk tumor-stroma. Indeed, our data demonstrate how ER-breast cancer cell lines, MCF-7 and T47D, cocoltured with conditioned media derived from GW4064-treated CAFs, exhibit a significantly reduced anchorage-independent growth and migration. In vivo xenograft studies, using MCF-7 cells alone or co-injected with CAFs, showed that GW4064 administration markedly reduced tumor growth. Thus, FXR ligands might represent an emerging potential anti-cancer therapy able to block the tumor supportive role of activated fibroblasts within the breast microenvironment
Advanced and smart nanocarriers for pharmaceutical applications
(Università della Calabria, 2020-04-17) Mazzotta, Elisabetta; Andò, Sebastiano; Muzzalupo, Rita
The application of nanotechnology in drug formulation has made significant headway over the last decade. Nanoscale controlled release systems allow to revalue and reformulate old drugs through targeted delivery to the desired pathological site, improving therapeutic efficiency and reducing side effects. This innovative modality of drug delivery aims to create personalized, safer and effective treatments. A great interest of the academic and industrial research is focused on the design and development of advanced nanocarriers since is a profitable way in terms of costs, times and risks than the discovery of new drugs. Herein, an extensive variety of nanocarriers systems composed of different materials including lipids, polymers and non-ionic surfactants have been proposed for different pharmaceutical applications. Specifically, the carriers have been tailor-made designed to improve drug photostability, enhance skin permeation and realize smart tools for tumor target therapy.
Advanced functionalized materials for multipurpose applications
(Università della Calabria, 2021-03-21) Pantuso, Elvira; Andò, Sebastiano; Nicoletta, Fiore
Advanced materials for pharmaceutical and biomedical purposes
(2018-02-27) Mellace, Silvia; Andò, Sebastiano; Cassano, Roberta
L'innovazione nella chimica dei materiali e nella nanotecnologia hanno sinergicamente contribuito all'avanzamento e allo sviluppo dei Drug Delivery Systems (DDS) creando devices in grado di proteggere farmaci e sostanze biologicamente attive, aumentarne l'assorbimento, modificarne e migliorarne la penetrazione intracellulare e la distribuzione. Il presente lavoro ha avuto come obiettivo la progettazione, la preparazione e la caratterizzazione di materiali che potrebbero contribuire a trasformare e ottimizzare le performances di vari agenti terapeutici. In sintesi, sono stati preparati diversi dispositivi medici e DDS, utilizzando perlopiù polimeri, poiché esiste un grande potenziale nella combinazione di molecole bioattive con i polimeri, per affrontare sfide in campo farmaceutico e biomedico. Nella progettazione di questi nuovi materiali che sono biocompatibili e biologicamente attivi l’attenzione è stata anche focalizzata sull'applicazione di metodi in vitro e in silico per una previsione efficace ed efficiente dell’attività in vivo. In conclusione, la sintesi di nuovi materiali, l'adozione di polimeri naturali come carriers e una migliore comprensione del rapporto struttura-funzione hanno permesso lo sviluppo di DDS e devices con incoraggianti risultati sperimentali che suggeriscono un possibile utilizzo per una futura sperimentazione in ambito clinico
Application of computational methodologies toward the identification of novel therapeutics and photodegradation studies for the design of light-stable formulations
(Università della Calabria, 2021-06-10) Occhiuzzi, Maria Antonietta; Andò, Sebastiano; Grande, Fedora; Iole, Giuseppina
Benefits of advanced techniques and data processing for the analysis of complex biological and food matrices
(2019-03-03) Spatari, Claudia; Andò, Sebastiano; Ragno, Gaetano
Durante i tre anni di dottorato in Medicina Traslazionale, il mio lavoro di ricerca si è concentrato sull'applicazione di tecniche analitiche avanzate e sull'elaborazione dei dati per lo studio di matrici complesse biologiche e alimentari. Recenti studi hanno dimostrato che in circa il 10% dei campioni di latte materno acquistato online è presente DNA bovino che dimostra adulterazione intenzionale. I rischi associati al consumo da parte del neonato di latte umano adulterato con contaminanti animali o altro sono molti e gravi, tra cui carenza di ferro, disidratazione, aumento del potenziale di carico di soluto renale (PRSL) e reazioni allergiche, motivo per il quale risulta fondamentale la ricerca di eventuali adulteranti nel latte materno. L'applicazione di tecniche chemiometriche sullo spettro IR del latte materno si è dimostrata molto efficace nel tracciare anche minime variazioni nella composizione e nelle caratteristiche del latte umano, essendo in grado di sfruttare le informazioni non specifiche memorizzate nello spettro IR. In questo caso, l'elaborazione delle impronte digitali spettrali ATR-FTIR mediante regressione PCA e PLS, è stata in grado di rilevare l'aggiunta fraudolenta di acqua o latte di mucca. In particolare, la tecnica PLS-DA è risultata essenziale per riconoscere il latte materno puro dal latte adulterato. Un'ulteriore definizione di quattro modelli PLS1 ha consentito inoltre la determinazione della quantità di adulteranti specifici aggiunti. La ricerca sulle matrici alimentari è stata estesa a una serie di oli commestibili al fine di verificare la loro fotostabilità. Tecniche di irradiazione forzata, in combinazione con analisi spettroscopica UV-vis, FTIR-ATR e cromatografica HPLC-DAD, hanno mostrato cambiamenti quantitativi e qualitativi dei principali acidi grassi. La ricerca si è concentrata in seguito sull'olio di lino, data la sua grande importanza come alimento funzionale. Anche in questo caso, la spettroscopia UV e l'HPLC hanno rivelato cambiamenti significativi nella concentrazione di acidi grassi, ridotti al 35% dopo 48 ore di esposizione alla luce. La quantità di lignani, altri importanti componenti nutraceutici, ha invece mostrato una significativa stabilità. La fotoprotezione dell’olio di lino è stata in seguito dimostrata dall’uso di contenitori di vetro ambrato associato all’aggiunta di ascorbil palmitato quale agente antiossidante. I risultati ottenuti sono importanti per aumentare la durata di conservazione dell'olio di semi di lino o di altri oli commestibili, mediante l'adozione di formulazioni appropriate e accurata protezione fisica. Il monitoraggio dei farmaci nei fluidi biologici ha rappresentato un altro argomento importante del mio lavoro di tesi. Particolare attenzione è stata rivolta allo sviluppo di un metodo analitico per il monitoraggio della quantità dell’anestetico bupivacaina nel sangue del cordone ombelicale. La determinazione del farmaco è stata definita mediante un metodo di estrazione SPE seguito da analisi HPLC e GC-MS. Questo studio sta procedendo con l'analisi di un gran numero di campioni reali, al fine di valutare la sicurezza degli anestetici somministrati durante il parto naturale e nel contempo ottimizzare il protocollo terapeutico attualmente utilizzato in partoanalgesia. Un'esperienza fondamentale durante il dottorato è rappresentata dal periodo trascorso presso un laboratorio di ricerca dell'Università di Utrecht in Olanda. Qui ho avuto l'opportunità di studiare per un semestre (dal 26 settembre 2016 al 27 Marzo2017) presso il laboratorio di ricerca guidato dal prof. Rolf Sparidans. In tale occasione ho approfondito le mie conoscenze sull'uso della cromatografia LC-MS/MS applicata allo studio della farmacocinetica di nuovi farmaci antitumorali. In particolare ho partecipato allo studio di un saggio bioanalitico del farmaco lorlatinib, un inibitore ALK di terza generazione. La preparazione del campione e l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche sono state le fasi più impegnative del lavoro essendo stato il primo test sviluppato e validato per questo prodotto. Una procedura LC-MS / MS è stata ottimizzata e validata sul sangue di topi al fine di stabilirne le proprietà farmacocinetiche Ancora presso il gruppo di ricerca dell’Unical, parte dell’attività di ricerca è stata svolta su matrici farmaceutiche. In particolare si è studiata la stabilità in soluzione acquosa e alla luce di una 1,4-diidropiridina (siglata M3) di nuova sintesi, data la nota scarsa solubilità e fotolabilità di questa classe di farmaci. Una serie di tensioattivi, tra questi i tween, è stata testata per promuovere la solubilità in acqua, ottenendo risultati incoraggianti con l'uso del tensioattivo non ionico Tween20. Successivamente, la fotostabilità del complesso M3-Tween20 è stata studiata vagliando la capacità fotoprotettiva del materiale di diversi contenitori: quarzo, PET blu, PET ambrato, vetro scuro rivestito. La migliore fotoprotezione è stata garantita dal PET ambrato e dal contenitore in vetro scuro. I risultati ottenuti dimostrano che l'uso combinato di tensioattivi e contenitori specifici rappresenta una strategia interessante da applicare ai farmaci fotolabili e a carattere prevalentemente lipofilo
Breast tumor microenvironment and endocrine resistance: dissecting the molecular link
(Università della Calabria, 2023-07-04) Caruso, Amanda; Catalano, Stefania; Andò, Sebastiano
Charatterization of store-operated calcium entry in the neuroimmune response evoked by ischemic preconditioning in mice subjected to middle cerebral artery occlusion
(Università della Calabria, 2021-06-10) Frisina, Marialaura; Andò, Sebastiano; Amantea, Diana
Cerebral ischemia is one of the leading causes of death and long-term disability worldwide. Currently approved therapies for ischemic stroke are limited to reperfusion through mechanical recanalization and/or pharmacological thrombolysis; however, only a small percentage of eligible patients may benefit from this treatment due to its contraindications and, furthermore, it does not provide neuroprotective effects. In this context, several studies have highlighted the potential of inducing ischemic tolerance by stimulating endogenous neuroprotection. To this aim, brain ischemic preconditioning (PC), namely a sublethal ischemic event able to increase the resistance of the brain against a subsequent, more intense ischemic insult, has been considered as a useful experimental paradigm to investigate the mechanisms implicated in brain tolerance. A deep comprehension of endogenous neuroprotection elicited by ischemic PC represents a promising approach to identify novel targets that can be translated into stroke therapy. One of the main factors involved in the progression of neuronal damage during cerebral ischemia is the alteration of cellular Ca2+ homeostasis. Indeed, cytosolic Ca2+ overload due to increased membrane permeability or to its leak from intracellular organelles could result in neuronal demise. Detrimental effects involve the activation of a series of Ca2+-dependent enzymes that degrade cellular components or activate death pathways, and the formation of cytotoxic products that cause irreversible mitochondrial damage and cellular demise. The main objective of the present research work was to investigate the involvement of store-operated calcium entry (SOCE) in brain ischemia and ischemic preconditioning in mice subjected to focal cerebral ischemia. Following an ischemic insult and depletion of Ca2+ stores, the endoplasmic reticulum Ca2+ sensor stromal interaction molecule (STIM)1 interacts with the Ca2+ selective plasmamembrane channel Orai1, to promote SOCE, that may protect neurons by re-establishing Ca2+ homeostasis or could also be the source of excessive Ca2+ influx, thus causing nonexcitotoxic neuronal death. This Ca2+ influx is regulated by SOCE-associated regulatory factor (SARAF) that associates with STIM1 and promotes a slow Ca2+- dependent inactivation of SOCE, or directly interacts with Orai1 to promote SOCE activation in the absence of STIM1. Furthermore, SOCE represents the main source of Ca2+ in immune cells, regulating several of their critical functions. Besides the pivotal role played by immune mediators in the evolution of cerebral ischemic damage, it has been demonstrated that the innate immune system is also an essential component of the delayed ischemic tolerance elicited in the brain by ischemic PC. Therefore, we investigated whether central and peripheral innate immune responses contribute to PC-induced ischemic tolerance and if modulation of different SOCE components occurs in ischemic damage (1h middle cerebral artery occlusion, MCAo, followed by 24h of reperfusion) and/or in neuroprotection conferred by ischemic PC (15 min MCAo, 72h before) in C57BL/6J adult male mice. Ischemic PC significantly reduced histological damage and neurological deficits produced in mice by a more severe ischemia of 1h. Western blot analysis revealed that Orai1 expression is not affected by the ischemic insult preceded or not by the PC stimulus in the frontoparietal ischemic cortex. However, Orai1 expression was detected in neurons, but also in Ly6B.2+ myeloid cells infiltrating the ischemic hemisphere. By contrast, STIM1 and SARAF expression, mainly found in NeuN+ neurons, was significantly reduced in the ischemic cortex. Interestingly, ischemic PC prevented SARAF downregulation in the ischemic cortex, thus suggesting that this regulatory factor may play a crucial role in SOCE-mediated tolerance. To assess the immunomodulatory effects of ischemic PC, we performed ELISA assay to demonstrate that cerebral damage was associated with increased protein levels of the proinflammatory cytokine IL-1β in the ischemic cortex, while this effect was prevented by the PC stimulus. Regarding alternatively-activated phenotypes, western blot analysis revealed a significant elevation of the expression of Ym1, marker of M2-polarized microglia/macrophages, in the ischemic cortex as compared to contralateral tissue. Interestingly, ischemic PC further increased Ym1 expression in the ipsilateral cortex as compared to MCAo group. Immunohistochemical analysis revealed that the majority of Ym1+ cells are mainly amoeboid CD11b+ myeloid cells, very likely monocytes/macrophages infiltrating from blood vessels. Thus, elevated brain infiltration of these phenotypes is very likely involved in the protective effects of ischemic PC. The involvement of the peripheral immune response was confirmed by the evidence that the 70% increase in spleen weight observed after 1h MCAo was abolished in mice pre-exposed to PC. Accordingly, flow cytometry analysis revealed that PC significantly attenuates elevation of neutrophil counts (Ly-6G+ events) induced by 1h MCAo in blood. Since the Ca2+-selective plasmamembrane channel Orai1 is crucial in the recruitment of immune cells during inflammation, we have analysed its expression in the whole population of circulating leukocytes and in neutrophils, demonstrating that the number of Orai1+ cells, mainly corresponding to Ly-6G+ neutrophils, was significantly enhanced in the blood after the ischemic insult, as compared to sham, regardless of whether mice received or not ischemic PC. In conclusion, this research project reaffirms that cerebral ischemic tolerance induced by PC involves both central and peripheral modulation of the innate immune system, further underscoring the relevance of exploiting immunomodulatory approaches for the development of effective stroke therapies and originally demonstrates that preventing SARAF downregulation could represent an important neuroprotective mechanism aimed at preserving SOCE functions, making SARAF a valuable target to protect neurons from the ischemic damage.
Chemical modifications of polyphenols for the development of new molecules foods for the treatment of metabolic disorders
(Università della Calabria, 2020-07-01) Carullo, Gabriele; Andò, Sebastiano; Aiello, Francesca
Metabolic disorders represent the principal cause of death in the industrialized world, affecting several people, because of their incorrect lifestyle. Among them, Type 2 Diabetes Mellitus and related comorbidities, such diabetic wounds, and hypertension represent the most studied examples of metabolism-associated diseases. In this context, the role of food-derived products and hybrid molecules has been investigated in this thesis. Two different braches have been investigated: one regarding food chemistry and one regarding medicinal chemistry. In food chemistry section, wine-making byproducts were used as starting point for the development of food ingredients able to modulate vascular tone in rat aortic rings. In particular, autochthonous (Calabria, southern Italy) white grape pomaces of Mantonico and Pecorello and red grape pomaces of Magliocco dolce (also known as Arvino) have been used. The pomaces were extracted in order to obtain samples, that were chemically-characterized and assayed in rat aorta rings. The results obtained and published demonstrated how these extracts were able to modulate vascular tone by a combination of antioxidant and nitric oxide-mediated effects; in the case of white pomaces, these effects were also assayed when the extract was embedded in a pectin matrix. In line with this, also a functional kefir was produced in order to evaluate its efficacy as anti-inflammatory agent for gastric epithelium, showing how the addition of the Sangiovese pomace extract was able to improve the activity of kefir. In medicinal chemistry section, the role of polyphenols, present in food products, was evaluated in order to drive their activity versus specific molecular pathways. In this field, we used quercetin, in combination with oleic acid, developing GPR40/FFA1 agonists that demonstrated to be useful insulin secretagogue agents. In particular, one derivative was also assayed in wound healing models, demonstrating the role of the receptor also in this proliferation process. In line with this, the GPR120/FFA4 demonstrated interesting pharmacological activities. Their agonists were able to modulate incretin secretion, with interesting anti-diabetic effect. Nevertheless, little structural determinants are present in literature. In this context, in my Spanish experience at University of Seville, I isolated (S)- pinocembrin from honey, and decided to create molecular hybrids, according to a homology model published. The hybrids obtained demonstrated a useful GPR120 agonist activity, promoting wound healing in HaCaT cell line. Furthermore, quercetin and morin were used as template for the development of new KCa1.1 and Cav1.2 channel modulators, with the aim of obtaining new suitable anti-hypertensive candidates. The results obtained showed how quercetin derivatives maintain their activity versus KCa1.1 channel, while morin derivatives demonstrated to activate KCa1.1 channel, behavior not registered in the case of parent compound. These results are now under review for publication.
Contribution of flavonoids and iridoids to health properties of edible plants of Arbutas, Cornas, and Vuccinium genera from Mediterranean area
(Università della Calabria, 2020-06-19) Tenuta, Maria Concetta; Tundis, Rosa; Andò, Sebastiano; Deguin, Brigitte; Lallemand, Marie-Christine
Aim of the study: Natural compounds produced by the “nature laboratory” continue to play a leading role in the process of discovering and developing of new drugs, food supplements and/or functional foods. Today, in fact, we are witnessing a renewed interest in these products for the prevention and treatment of numerous diseases, including those associated with oxidative stress such as diabetes and inflammatory diseases. In this context, the present research project aimed at identifying the best techniques that allow the extraction of two classes of active compounds, flavonoids and iridoids, from the fruits and leaves of Arbutus unedo L., Vaccinium corymbosum L., Cornus mas L., and Cornus sanguinea L. Their edible fruits but also their leaves (considered byproducts) represent rich sources of bioactive compounds. The work continued with the evaluation of in vitro biological activity and the fractionation of the most active extracts in order to envisage their potential use as a source of bioactive compounds for the development of functional foods, nutraceuticals and/or food supplements . Materials and methods: The chemical profile of extracts was evaluated by using LC/ESI/QTOF/MS. Four different in vitro tests (DPPH, ABTS, -carotene bleaching test and FRAP), were performed to investigate the antioxidant activity. The potential hypoglycaemic activity was investigated by the inhibition of -amylase and -glucosidase enzymes. The inhibitory effects of the extracts on the production of nitric oxide have been studied by Griess assay. The most active extracts of C. mas and C. sanguinea were subjected to fractionation in order to obtain a separation of flavonoids and iridoids using XAD-16 resin. Obtained fractions were tested to evaluate their ability to reduce the activation of the NF-kB factor. Results: LC/ESI/QTOF/MS analyses detected for the first time in the A. unedo the presence of ellagic acid 4-O--D-glucopiranoside, kaempferol 3-O-glucoside, myricetin, myricetin 3-O-rhamnopiranoside, naringenin 7-O-glucoside, isovitexin 7-O-glucoside, and norbergenine and V. corymbosum the presence of the iridoids scandoside, vaccinoside, geniposide, and dihydromonotropein. The complete chemical characterization of C. sanguinea fruits and leaves was conducted herein for the first time, reporting the presence of flavonoids and iridoids. Worthy of note are the results obtained from the hypoglycaemic activity. The extracts of both Cornus species showed a high inhibition of -glucosidase and a moderate inhibition of -amylase. Of particular note were the results obtained with the hydroalcoholic maceration of leaves and dried fruits of C. mas (TDB and MDB), the ethanol maceration of fresh leaves (PF1) and the hydroalcoholic maceration of dry leaves (SD2) of C. sanguinea, which for this reason were subjected to fractionation using XAD-16 resin. C. sanguinea PF1 (II) and SD2 (II) fractions showed the best antioxidant and NF-KB inhibition activity. Conclusion: All the investigated extracts showed a promising antioxidant, hypoglycaemic and anti-inflammatory potential, confirming the positive contribution of the two classes of compounds under study, flavonoids and iridoids, suggesting their potential use as a rich source of useful bioactive compounds for the formulation of new products to prevent diseases associated with oxidative stress such as inflammatory diseases and diabetes. In particular, results obtained with the C. sanguinea fractions PF1 (II) and SD2 (II) encourage researchers to continue the study with further in vivo studies. Scopo dello studio: I composti naturali prodotti dal “laboratorio natura” continuano ad avere un ruolo di primo piano nel processo di scoperta e sviluppo di nuovi farmaci, integratori alimentari e/o alimenti funzionali. Oggi, infatti, si assiste a un rinnovato interesse nei riguardi di tali prodotti nella prevenzione e nel trattamento di numerose patologie, tra cui quelle associate allo stress ossidativo come diabete e malattie infiammatorie. In questo ambito si inserisce il presente lavoro di ricerca, volto all’identificazione delle migliori tecniche che consentano l’estrazione di due classi di principi attivi, i flavonoidi e gli iridoidi, dai frutti e dalle foglie di Arbutus unedo L., Vaccinium corymbosum L., Cornus mas L. e Cornus sanguinea L. I loro frutti commestibili ma anche le foglie (considerate prodotti di scarto) rappresentano ricche fonti di composti bioattivi. Il lavoro ha quindi riguardato la valutazione dell’attività biologica in vitro e il frazionamento bio-guidato degli estratti risultati più attivi al fine di prospettare un loro potenziale impiego come fonte di composti bioattivi per lo sviluppo di alimenti funzionali, nutraceutici e/o integratori alimentari. Materiali e metodi: Il profilo fitochimico degli estratti è stato valutato mediante LC/ESI/QTOF/MS. Per la determinazione in vitro della capacità antiossidante sono stati eseguiti quattro diversi test (DPPH, ABTS, FRAP e-carotene bleaching test). La potenziale attività ipoglicemizzante è stata investigata mediante l’inibizione degli enzimi -amilasi e -glucosidasi. Gli effetti inibitori degli estratti sulla produzione di ossido nitrico sono stati studiati mediante saggio di Griess. Gli estratti maggiormente attivi di C. mas e C. sanguinea sono stati sottoposti a frazionamento per la separazione di flavonoidi e iridoidi mediante l’impiego della resina XAD-16. Le frazioni ottenute sono state saggiate per valutare la capacità di ridurre l’attivazione del fattore NF-kB. Risultati: L’analisi LC/ESI/QTOF/MS ha rilevato per la prima volta nell’A. unedo la presenza di acido ellagico 4-O--D-glucopiranoside, kaemferolo 3-O-glucoside, miricetina, miricetina 3-O-ramnopiranoside, naringenina 7-O-glucoside, isovitexina 7-O-glucoside, e norbergenina e nel V. corymbosum la presenza degli iridoidi scandoside, vaccinoside, geniposide e diidromonotropeina. La caratterizzazione chimica completa di frutti e foglie del C. sanguinea è stata condotta per la prima volta, riportando la presenza flavonoidi ed iridoidi. Degni di nota sono i risultati ottenuti dall’attività ipoglicemizzante. Gli estratti di entrambe le specie di Cornus hanno mostrato un’alta inibizione dell’-glucosidasi e una moderata inibizione dell’-amilasi. Di particolare rilievo sono stati i risultati ottenuti con la macerazione idroalcolica di foglie e frutti secchi di C. mas (TDB e MDB), la macerazione in etanolo delle foglie fresche (PF1) e la macerazione idroalcolica delle foglie secche (SD2) di C. sanguinea, che per tale motivo sono stati sottoposti a bio-frazionamento mediante l’impiego della resina XAD-16. Le frazioni PF1 (II) e SD2 (II) del C. sanguinea hanno mostrato la migliore attività antiossidante e di inibizione dell’NF-KB. Conclusioni: Tutti gli estratti investigati hanno mostrato un promettente potenziale antiossidante, ipoglicemizzante ed antinfiammatorio, confermando il positivo contributo delle due classi di composti oggetto di studio, i flavonoidi e iridoidi prospettando il loro potenziale impiego come ricca fonte di composti bioattivi utili per la formulazione di nuovi prodotti per prevenire le malattie associate allo stress ossidativo come malattie infiammatorie e diabete. In particolare, i risultati ottenuti con le frazioni PF1 (II) e SD2 (II) del C. sanguinea incoraggiano i ricercatori nel proseguire lo studio con eventuali studi in vivo. Résumé Objet de l’étude : Les substances naturelles produites par le laboratoire « Nature » continuent de jouer un rôle de premier plan dans le processus de découverte et de développement de nouveaux médicaments, compléments alimentaires et/ou aliments fonctionnels. Aujourd’hui, en effet, nous assistons à un regain d'intérêt pour ces produits pour la prévention et le traitement de nombreuses maladies, notamment celles associées au stress oxydatif, telles que le diabète et les maladies inflammatoires. Le présent travail de recherche vise à identifier les meilleures techniques permettant d’extraire deux classes de principes actifs, les flavonoïdes et les iridoïdes, des fruits et des feuilles d’Arbutus unedo L., Vaccinium corymbosum L., Cornus mas L. et Cornus sanguinea L. Leurs fruits comestibles, comme leurs feuilles pourtant actuellement considérées comme des déchets représentent de riches sources de composés bioactifs. Les travaux ont donc porté sur l'évaluation de l'activité biologique in vitro et le fractionnement bio-guidé des extraits les plus actifs afin d'envisager leur utilisation potentielle comme source de composés bioactifs pour le développement d'aliments fonctionnels, et nutraceutiques. Matériels et méthodes : Le profil phytochimique des extraits a été évalué par LC/ESI/QTOF/MS. Pour la détermination in vitro de la capacité antioxydante, quatre tests différents ont été réalisés (DPPH, ABTS, FRAP et-carotene bleaching test). L’activité hypoglycémique potentielle a été étudiée par inhibition des enzymes -amylase et -glucosidase. Les effets inhibiteurs des extraits sur la production d'oxyde nitrique ont été étudiés par le test de Griess. Les extraits les plus actifs de C. mas et C. sanguinea ont été soumis à un bio-fractionnement pour la séparation des flavonoïdes et des iridoïdes au moyen de la résine XAD-16. Les fractions obtenues ont été testées pour évaluer l'aptitude à réduire l’activation du facteur NF-kB. Résultats : L’analyse par LC/ESI/QTOF/MS détectée pour la première fois dans l’A. unedo la présence d’acide ellagique 4-O--D-glucopiranoside, de kaempférol 3-O-glucoside, de myricétine, de myricétine 3-O-rhamnopyranoside, de naringénine 7-O-glucoside, d'isovitexine 7-O-glucoside et de norbergénine, et V. corymbosum la présence d'iridoïdes scandoside, vaccinoside, géniposide et dihydromonotropeine. La caractérisation chimique complète des fruits et des feuilles de C. sanguinea a été réalisée pour la première fois, en indiquant la présence de flavonoïdes et d'iridoïdes. Il convient de noter les résultats obtenus à partir de l’activité hypoglycémique. Les extraits des deux espèces de Cornus ont montré une forte inhibition de l’-glucosidase et une inhibition modérée de l'-amylase. Résultats intéressants ont été obtenus avec la macération hydro-alcoolique de feuilles et de fruits séchés de C. mas (TDB et MDB), la macération en éthanol des feuilles fraîches (PF1) et la macération hydro-alcoolique de feuilles sèches (SD2) de C. sanguinea qui, pour cette raison, ont été soumis à un fractionnement avec la résine XAD-16. Les fractions PF1 (II) et SD2 (II) de C. sanguinea présentaient la meilleure activité inhibitrice des antioxydants et du NF-kB. Conclusion: Tous les extraits étudiés ont montrés un potentiel antioxydants, hypoglycémiants et anti-inflammatoire, confirmant l’apport positif des deux classes de composés étudiés, les flavonoïdes et les iridoïdes, suggérant leur utilisation potentielle comme source riche de composés bioactifs utiles pour la formulation de nouveaux produits pour prévenir les maladies associées au stress oxydatif, telles que les maladies inflammatoires et le diabète. En particulier, les résultats obtenus avec les fractions PF1 (II) et SD2 (II) de C. sanguinea incitent les chercheurs à poursuivre l’étude en proposant éventuellement des études in vivo.
Design and development of new functional materials for pharmaceutical and biomedical purposes
(Università della Calabria, 2022-02-15) Curcio, Federica; Andò, Sebastiano; Trombino, Sonia
Effect of bergamot essential oil and its constituent linalool on myogenic and neuronally-mediated contractions of human and rat isolated colon: potential benefits in complementary treatment of intestinal diseases
(Università della Calabria, 2020-07-01) Straface, Marilisa; Andò, Sebastiano; Morrone, Luigi
Introduction Bergamot essential oil (BEO) is used in aromatherapy and as an additive to food and drink to promote a citrus flavour. In animal models, BEO can modulate the synaptic functions within the Central Nervous System. However, it is not known if BEO can affect the functions of the gastrointestinal tract, despite being widely used in the food industry. BEO and its components linalool, limonene and linalyl-acetate were therefore examined for their ability to influence neuromuscular contractions of human and rat isolated colon. Material and Methods Human colon was obtained at surgery for bowel cancer following informed consent; mucosa-free strips were cut parallel to the circular muscle. Rat colon (Sprague-Dawley) strips were also cut as circular muscle preparations. In most experiments, each strip was suspended between platinum wire electrodes in tissue baths containing Krebs solution (5% CO2 in O2; 37°C) under tension (1 or 2g of tension for rat and human muscle strips, respectively) for recording of isometric contractions in response to stimulation of cholinergic nerves using electrical field stimulation (EFS) or to the application of exogenous stimulants of smooth muscle contraction (acetylcholine (ACh), 5-hydroxytryptamine (5-HT), substance P (SP) or KCl). Cumulative concentration-response curves were obtained for BEO (10-6 - 10-3 % v/v) and its major components linalool, limonene and linalyl-acetate (10-9 - 10-4 M). The inhibition of the amplitude of the contractions by each agent was expressed in percentage terms as the mean  s.e.m of the numbers of patients or animals. Results In preliminary experiments, BEO and its components reduced contractions of rat colon caused by ACh, 5-HT or SP. Subsequently concentration-dependent inhibition of both KCl-evoked contractions and neuronally-mediated contractions were demonstrated in response to BEO or its components, with greater potency when tested on the latter. The inhibitory effect of BEO on myogenic and neuronally-mediated contractions was associated largely via the actions of linalool (apparent pIC50 5.6 ± 0.4, n= 4 on KCl-evoked contractions; apparent pIC50 6.7 ± 0.2, n = 4 on neuronally-mediated contractions) in human colon. Similar but less potent activity of linalool was obtained in rat colon (apparent pIC50 5.4 ± 0.3, n = 4 on KCl-evoked contractions; apparent pIC50 5.8 ± 0.1 %, n = 4 on neuronally-mediated contractions). Conclusion The results indicated that BEO, largely via the actions of linalool, inhibited both human and rat enteric neurotransmission. Some species differences were found in the ability of these substances to inhibit neuronally-mediated contractions; the rank order in terms of potency (apparent pIC50) in human was: linalool > limonene >> linalyl acetate = BEO, and in rat was: linalyl acetate > limonene = linalool >> BEO. Both BEO and linalool were more potent in human muscle strips, acting at least partly by directly inhibiting muscle contractility. These data provide a potential mechanism for their use as a complementary treatment of gastrointestinal diseases related to increased intestinal motility.
Estratti naturali ad azione polivalente sui pathway di alterazioni metaboliche
(2018-02-27) Casacchia, Teresa; Andò, Sebastiano; Statti, Giancarlo
Estrogen receptor alpha interferes with LKBl/AMPK/mTOR signaling activation in adiponectin-treated breast cancer cells
(2018-02-27) Naimo, Giuseppina Daniela; Andò, Sebastiano; Panno, Maria Luisa; Mauro, Loredana
Breast cancer is the most common type of tumor and the leading cause of cancer-related deaths in women, worldwide. The cause of breast cancer is multifactorial and includes hormonal, genetic and environmental cues. Obesity is now an accepted risk factor for breast cancer in postmenopausal women, particularly for the hormone-dependent subtype of mammary tumor. Obesity has regarded as a multifactorial disorder characterized by an increased number and size of adipocytes. Adipose tissue is an active metabolic and endocrine organ that secretes many adipocytokines, which act as key mediators in several obesity-associated diseases. Among these, adiponectin represents the most abundant adipose tissue-excreted protein, which exhibits insulin sensitizing, antiinflammatory, and antiatherogenic properties Adiponectin has been proposed as having a key role in the pathogenesis of cardiovascular disease and type 2 diabetes along with obesity-associated malignancies, such as breast cancer. An inverse correlation is reported between obesity and adiponectin, for which low levels of adiponectin represent a risk factor for breast cancer. The role of adiponectin on breast tumorigenesis seems to be dependent on cell phenotypes. Indeed, several in vitro and in vivo studies demonstrated that low adiponectin levels repressed growth in ER-negative breast cancer cells whereas increased proliferation in ER- positive cells. Adiponectin interacts with specific receptors and exerts its effects, including regulation of cell survival, apoptosis and metastasis, via a plethora of signaling pathways. The key molecule of adiponectin action is AMP-activated protein kinase (AMPK), which is mainly activated by liver kinase B1 (LKB1). On the basis of this observations, the aim of the present study was to investigate the effect of adiponectin on LKB1/AMPK signaling in ER-negative (MDA-MB-231) and positive (MCF-7) breast cancer cells. In MCF-7 cells, upon low adiponectin levels, ER impaired LKB1/AMPK interaction by recruiting LKB1 as coactivator at nuclear level, sustaining breast tumor growth. In this condition, AMPK signaling was not working, letting fatty acid synthesis still active. In contrast, in MDA-MB-231 cells the phosphorylated status of AMPK and ACC appeared enhanced, with consequent inhibition of both lipogenesis and cell growth. Thus, in the presence of adiponectin, ERα signaling switched energy balance of breast cancer cells towards a lipogenic phenotype. The same results on tumor growth were reproduced in a xenograft model. These results emphasize how adiponectin action in obese patients is tightly dependent on ERα, addressing that adiponectin may work as growth factor in ERα- positive breast cancer cells.
Estrogen Receptor beta, through Sp1, recruits a corepressor complex to the Estrogen Receptor alpha gene promoter in breast cancer cells
(2012) Zito, Domenico; Sisci, Diego; Andò, Sebastiano
Human Estrogen receptors alpha (α) and beta (β) are essential components of a complex signal transduction pathway that regulates mammary growth and development. Several studies have reported that normal breast tissues display a relative higher expression of ERβ than ERα, which drastically changes during breast tumorogenesis. Thus, it is reasonable to suggest that a dysregulation of the two estrogen receptor subtypes may induce breast cancer development. However, the molecular mechanisms involved in the potential opposing roles played by the two estrogen receptors on tumor cell growth still needs to be elucidated. In the present study, we have demonstrated that ERβ overexpression in breast cancer cells decreases cell proliferation and down-regulates ERα mRNA and protein content, with a concomitant repression of estrogen-regulated genes. Transient transfection experiments, using a vector containing the human ERα promoter region, showed that elevated levels of ERβ down-regulated basal ERα promoter activity. Furthermore, site-directed mutagenesis and deletion analysis revealed that the proximal GC-rich motifs at −223 and -214 are critical for the ERβ-induced ERα down-regulation in breast cancer cells. This occurred through ERβ-Sp1 proteinprotein interactions within the ERα promoter region and the recruitment of a corepressor complex containing the nuclear receptor corepressor NCoR, accompanied by hypoacetylation of histone H4 and displacement of RNA polymerase II. Silencing of NCoR gene expression by RNA interference reversed the down-regulatory effects of ERβ on ER α gene expression and cell proliferation Collectively, these results suggest a novel mechanism by which overexpression of ERβ, through NCoR, is able to down regulate ERα expression, thus repressing ERα’s main role on breast cancer cell growth
Estrogen Related Receptor α (ERRα): a new target linking metabolism to Adrenocortical cancer progression
(Università della Calabria, 2022-06-14) Nocito, Marta Claudia; Pezzi, Vincenzo; Andò, Sebastiano
I Carcinomi surrenalici (ACC) sono tumori rari e altamente aggressivi, associati a una prognosi infausta per un alto rischio di recidiva e di opzioni terapeutiche limitate [Stojadinovic A. et al., 2002]. Ad oggi sono stati indicati diversi approcci terapeutici, ma la chirurgia rimane il trattamento di prima scelta per la rimozione del tumore primario o delle metastasi isolate [Crucitti F. et. al., 1996]. L’evidenza della presenza di recidive o metastasi in regioni distali in un terzo dei pazienti trattati chirurgicamente fa emergere la necessità di individuare una terapia adiuvante che possa eliminare questo rischio [Donatini G. et. al., 2014]. Ad oggi, il Mitotano rappresenta l’unico farmaco approvato negli USA e in Europa per il trattamento dell’ACC. La chemioterapia è riservata agli stadi avanzati della malattia, con evidenti metastasi resistenti al trattamento con mitotano. L’eziologia del cancro surrenale rimane ancora ignota, ma studi effettuati negli ultimi 10 anni suggeriscono che alcune mutazioni genetiche nella ghiandola surrenale sono alla base della genesi di un tumore maligno. Quella più diffusa interessa il locus (11p15) del fattore di crescita II insulino-simile (IGF-II). Infatti, l’IGF-II è over-espresso nel 90% degli ACCs e determina un effetto mitogenico autocrino attraverso l’attivazione delle vie di segnalazione mediate dal recettore IGF1R [Logie A. et al., 1999] quale la via Ras/MEK/ERK e Pi3K/Akt. È stata inoltre rilevata una upregulation dell’IGFIR nel 90% dei casi [Giordano T.J. et al., 2003]. Studi seguenti hanno evidenziato la presenza nell’ACC di un’overespressione del recettore estrogenico alfa (ER-α). Sirianni e collaboratori hanno meglio definito i pathways innescati in risposta all’attivazione dell’ER-α dimostrando l’esistenza di un cross-talk tra ERα ed IGFIR [Sirianni R. et al., 2012]. Inoltre, più recentemente [Casaburi I. et al., 2015] è stato osservato come nell’ACC via sia una overespressione dell’ERRα e che tale recettore è implicato nella patogenesi di questo tipo di tumore. È riportato che l’ERRα è un recettore nucleare coinvolto nel controllo di funzioni cellulari che riguardano principalmente il metabolismo energetico e la biogenesi mitocondriale [Villena J.A. et al., 2008] e che la diminuzione dell’espressione di ERRα è associata all’inibizione della crescita delle cellule tumorali [Stein R.A. et al., 2008]. Infatti, diversi studi hanno rilevato come ERRα possa rappresentare un marcatore prognostico del tumore al seno, alle ovaie, al colon e alla prostata [Kraus R.J. et al., 2002; Suzuki T. et al., 2004; Cavallini A. et al., 2005; Cheung C.P. et al., 2005]. La downregulation dell’espressione di ERRα potrebbe inibire, infatti, significativamente la crescita delle cellule tumorali [Wu Q. et al., 2013; Chang C.Y. et al., 2011], mentre la sovraespressione di ERRα è legata ad un esito clinico infausto e conferisce resistenza ai farmaci [Kraus R.J. et al., 2002; Suzuki T. et al., 2004]. Questi dati suggeriscono, quindi, che ERRα rappresenta un nuovo target molecolare per il trattamento del cancro [Stein R.A. et al., 2008]. In uno studio condotto in cellule H295R di tumore adrenocorticale [Casaburi I. et al., 2015], è stato dimostrato che la deplezione di ERRα dopo trattamento con un agonista inverso denominato XCT790, causa la riduzione della massa e della funzione mitocondriale portando all’attivazione di meccanismi che esitano nella morte delle cellule tumorali. Questi risultati confermano che ERRα svolge un ruolo importante nella regolazione della funzione mitocondriale e nella biogenesi mitocondriale nelle cellule di ACC supportando l’ipotesi che può essere considerato come un regolatore “master” della riprogrammazione metabolica nell’ACC. Recentemente è stata dimostrata una correlazione tra uso della curcumina e modulazione dell’espressione dell’ERRα. È stato evidenziato, infatti, come in cellule di osteosarcoma, la curcumina riduce l’espressione genica di ERRα attraverso l’upregolazione del microRNA miR-125. In particolare, è stato osservato come la curcumina promuove l’apoptosi attivando il signalling miR-125/ERRα [Chen P. et al., 2017]. La curcumina, il principale componente dei rizomi essiccati di Curcuma longa, è stata utilizzata come colorante alimentare per secoli nei paesi dell’Asia orientale [Malik M. et al., 2009]. Precedenti studi hanno dimostrato come la curcumina presenta una vasta gamma di attività farmacologiche tra cui quella anti-infiammatoria, anti-diabetica, cardio-protettiva e neuro-protettiva [Aggarwal B.B. et al., 2005]. Inoltre, la curcumina è in grado di promuovere la guarigione di ferite, proteggere dalle lesioni epatiche, dalla formazione di cataratta e dalla tossicità polmonare [Aggarwal B.B. & Harikumar K.B., 2009]. Nel 1995 alcuni ricercatori [Menon L.G. et al., 1995] proposero la possibilità che la curcumina avesse un effetto antitumorale. Da allora, l’attività anticancro della curcumina è stata ampiamente studiata. Prove crescenti suggeriscono che la curcumina può essere utilizzata sia per la prevenzione che per il trattamento in diversi tipi di tumori umani [Anand P. et al., 2008; Ravindran J. et al., 2009; Bar-Sela G. et al., 2010; Quan-Jun Y. et al., 2015]. Negli Stati Uniti, il National Cancer Institute ha classificato la curcumina come agente anticancerogeno e chemo-preventivo di terza generazione [Odot J. et al., 2004]. Sebbene è stato dimostrato in diversi studi come la curcumina svolga un ruolo essenziale nell’inibire la proliferazione e la metastatizzazione delle cellule tumorali [Shishodia S. et al., 2007; Troselj K.G. & Kujundzic R.N., 2014], i meccanismi molecolari alla base del suo effetto antitumorale rimangono poco conosciuti. Inoltre, sebbene la curcumina abbia numerose attività farmacologiche, il suo utilizzo come agente terapeutico non è stato ancora approvato a causa della sua bassa biodisponibilità [Anand P. et al., 2007]. Tra i fattori che contribuiscono a questo limite possono essere inclusi: bassa solubilità in acqua, scarso assorbimento, bassa distribuzione tissutale, alto tasso di metabolismo, inattività dei prodotti metabolici e/o rapida eliminazione e clearance dall’organismo [Ravindranath V. & Chandrasekhara N., 1980]. Gli effetti farmacologici ottimali richiedono una dose orale maggiore di 0,8 g/die. Pertanto, nel corso degli anni, al fine di migliorare il profilo farmacocinetico della curcumina e l’assorbimento cellulare, sono state sviluppate diverse strategie. Queste includono derivati strutturali della curcumina, preparazione di analoghi e nuovi sistemi di somministrazione di farmaci che potrebbero migliorarne la solubilità e prolungarne il tempo di permanenza nel plasma. Recentemente, diverse ricerche sono state effettuate con lo scopo di formulare “delivery systems” più efficienti come ad esempio l’incapsulazione della curcumina in nanoparticelle polimeriche o in liposomi che però non hanno ottenuto molto successo [Ji H. et al., 2016]. Recentemente è stato messo a punto un sistema alternativo ai tradizionali “delivery systems” denominato “Solid Lipid Nanoparticles” (SLN) che offre diversi vantaggi nel trasporto di farmaci poco solubili. Il sistema SLN conferisce alla molecola bioattiva maggiore stabilità e biocompatibilità e minori problemi di tossicità rispetto ad altri sistemi di trasporto. Le SLN possono essere somministrate sia per via orale che per via parenterale o transdermica. A ciò si associa il vantaggio che le metodiche di preparazione delle SLN sono semplici e di facile esecuzione e necessitano di pochi eccipienti nella formulazione [Rompicharla S.V.K. et al., 2017]. Pertanto, la preparazione di una nuova formulazione utilizzando il sistema SLN potrebbe migliorare notevolmente la stabilità, la biodisponibilità e l’efficacia antitumorale della curcumina. Alla luce di questi dati di letteratura, lo scopo di questo lavoro di tesi era di indagare il ruolo di ERRα sui cambiamenti metabolici che si verificano in diverse linee cellulari ACC. Abbiamo anche studiato se i cambiamenti cellulari indotti dalla sovraespressione o dall'esaurimento di ERRα sono in grado di supportare o modulare la progressione dell'ACCCon la proteomica e l'analizzatore Seahorse XF, che consente l'analisi in tempo reale dei flussi glicolitici e mitocondriali, abbiamo studiato e rilevato un ruolo importante di ERRα nella regolazione dei cambiamenti metabolici nelle cellule ACC. Usando cloni stabili che sovraesprimono (ERR+/+) o con un'espressione del gene ESRRA silenziata (shERR-/-) nelle cellule ACC abbiamo rilevato che la sovraespressione di ERRα conferisce alle cellule ACC una migliore forma fisica mitocondriale mentre le cellule ERR-/- hanno una ridotta basale e massimale frequenza respiratoria e una ridotta capacità di riserva. Successivamente abbiamo studiato gli effetti della ridotta espressione di ERRα sulle funzioni bioenergetiche di tre linee cellulari ACC utilizzando XCT790. I risultati del test ATP mostrano che XCT790 ha abbassato i livelli di ATP nelle cellule H295R e SW13 sensibili al mitotano, mentre era inefficace nelle cellule MUC1 resistenti al mitotano. Infatti, l'analisi del contributo energetico dei mitocondri e della glicolisi rivela un'estrema plasticità metabolica nelle cellule MUC1 e H295R rispetto alle cellule SW13, che sembrano mostrare un fenotipo glicolitico. La valutazione delle funzioni mitocondriali ha rivelato la capacità di XCT790 di influenzare negativamente la frequenza respiratoria massima in tutte e tre le linee cellulari. È noto che le alterazioni metaboliche nelle cellule tumorali non sono esclusivamente associate a fenomeni di sopravvivenza e proliferazione ma incidono anche sulla motilità cellulare. I nostri dati hanno rivelato chiaramente un'influenza diretta dell'espressione di ERRα sulla motilità delle H295R. La sovraespressione di ERRα ha aumentato significativamente la migrazione delle cellule H295R e la vimentina del marker EMT mentre la downregulation del recettore metabolico, mediante ablazione genetica o con approcci farmacologici, ha mostrato una riduzione sia della motilità cellulare che dell'espressione della vimentina. Altri dati importanti provenienti dal nostro studio sono l'impatto di ERRα sulla capacità delle cellule H295R di crescere in condizioni non aderenti come sferoidi 3D, una caratteristica dell'aggressività tumorale che caratterizza le cellule staminali tumorali (TIC). XCT790 è stato in grado di ridurre la formazione e la motilità degli sferoidi 3D non solo nelle cellule SW13 ma anche, e soprattutto, nelle cellule MUC-1 resistenti al mitotano suggerendo, ancora una volta, che il targeting di ERRα potrebbe essere una chemioterapia efficace da considerare per il trattamento del mitotano fenotipo ACC resistente. . Nuovi recenti risultati hanno riportato il colesterolo come un nuovo ligando endogeno di ERRα. I nostri esperimenti confermano il ruolo del colesterolo come attivatore di ERRα che induce la motilità cellulare nelle cellule ACC. In questa tesi ci siamo anche chiesti se, oltre al colesterolo, esistessero altre molecole naturali in grado di modulare l'espressione e l'attività di ERRα. La nostra ricerca si è concentrata su un prodotto naturale derivato dalla pianta, la curcumina. I nostri risultati hanno mostrato chiaramente che la curcumina, riducendo l'espressione di ERRα, esercitava un effetto inibitorio dipendente dal tempo e dalla dose sulla crescita delle cellule H295R inducendo l'attivazione di eventi apoptotici. Inoltre, il test per ottenere colture di sferoidi 3D ha confermato come la curcumina possa modulare la capacità delle cellule H295R di espandersi, cioè di ridurre la loro capacità di metastatizzare, un atteggiamento strettamente correlato alla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) in cui le cellule epiteliali acquisiscono le caratteristiche delle cellule mesenchimali non polarizzate e migratorie. Inoltre, in base al ruolo metabolico di ERRα, l'uso della curcumina ha indotto cambiamenti significativi nel profilo bioenergetico delle cellule H295R. In particolare, i valori OCR ed ECAR ed i parametri energetici derivati dall'analisi dei dati di Seahorse e associati alle funzioni mitocondriali e glicolitiche, sono stati tutti ridotti dalla curcumina in modo dose dipendente. È noto che la limitazione dell'uso terapeutico della curcumina è dovuta principalmente alla sua scarsa biodisponibilità. Pertanto, al fine di migliorare il profilo farmacocinetico e l'assorbimento cellulare della curcumina, abbiamo prodotto SLN di curcumina e abbiamo riscontrato un maggiore effetto inibitorio dose-dipendente sulla proliferazione delle cellule H295R rispetto alla curcumina non modificata. Il trattamento con SLNs-CUR ha una risposta dose-dipendente sulla proliferazione cellulare maggiore rispetto alla curcumina talquale, con un'elevata significatività già alla dose di 10μM alle 24h, fino ad un'inibizione >75% nelle 72h di trattamento. Le cellule sono state anche trattate con il veicolo SLN alle stesse dosi e per 72 ore, per dimostrare che non ha effetti tossici quando somministrato da solo. In conclusione, in questa tesi è stato dimostrato che ERRα è un fattore regolatore chiave che modula il profilo metabolico e di conseguenza la motilità delle cellule ACC. È stato, inoltre, dimostrato che l'inibizione di questo recettore, da parte di molecole sintetiche o naturali, può bloccare fortemente non solo la crescita delle cellule ACC resistenti al mitotano, ma anche i processi di transizione delle cellule ACC a fenotipo più aggressivo e invasivo. Per questo motivo, ERRα può essere considerato un nuovo importante target da tenere in considerazione nella progettazione di una nuova strategia terapeutica per combattere la progressione del cancro corticosurrenale.
Evaluation of a PH-sensitive mesoporous silca -based nanosystem as a vehicle for targetedcancer therapy
(Università della Calabria, 2020-04-17) Nigro, Alessandra; Andò, Sebastiano; Sisci, Diego
Evidence that ANG II/AGTR1 signaling stimulates aromatase activity, enhances local estrogen production involved in Glioblastoma cell growth and progression
(Università della Calabria, 2021-04-01) Russo, umberto; Andò, Sebastiano; De Amicis, Francesca
FoxO3a reactivation restores the sensitivity to the antiestrogen treatment in tamoxifen resistant breast cancer
(2017-06-12) Donà, Ada Alice; Andò, Sebastiano; Sisci, Diego
Resistance to endocrine treatments is a major clinical challenge in the management of estrogen receptor alpha positive (ER+) breast cancers (BC). Although multiple mechanisms leading to endocrine resistance have been proposed, the poor outcome of this subgroup of BC patients demands additional studies. Here we show that the expression of FoxO3a transcription factor is strongly reduced in ER+ BC MCF-7 cells (wtMCF-7) that developed resistance to Tamoxifen (TamR). On the other hand, FoxO3a silencing (siF3a) was able to counteract Tam induced growth inhibition in wtMCF-7, demonstrating that FoxO3a is a mediator of cell response to Tam. To analyze the role of FoxO3a in the acquisition of a Tam resistant phenotype, TamR clones bearing an active FoxO3a (F3aAAA), whose expression can be induced by Doxycycline (Dox) were developed. FoxO3a re-activation was able to re-establish the sensitivity of TamR cells to the antiestrogen, inhibiting proliferation and cell cycle progression, as well as restoring Tam dependent apoptotic response. For a closer look at the molecular mechanisms involved, an unbiased proteomics analysis on F3aAAA-inducible TamR cells was conducted, unveiling novel interesting and potential mediators of the anti-proliferative and pro-apoptotic activity of FoxO3a, all worthy of future investigations. Kaplan-Meier (K-M) survival curves confirmed the relevance of FoxO3a also in a clinical setting, since high levels of the transcription factor strongly correlate to a positive response to tamoxifen therapy. Finally, to assess if FoxO3a reactivation is able to restore the sensitivity to Tam also in vivo, the widely used anti-epileptic drug (AED) Lamotrigine (LTG; Lamictal), which is able to induce FoxO3a expression in TamR cells leading to growth inhibition, was also tested on TamR deriving xenografts tumors, where it showed the same effects observed in vitro. Altogether, our data indicate that FoxO3a could not only be considered a good prognostic factor in ER+ BC, predicting a positive response to endocrine therapy, but also a key target to be exploited in combination therapy. In this context, LTG might represent a valid candidate to be used as an adjuvant to Tam therapy in patients at risk.