Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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Start date: 2010End date: 2012

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    Sviluppo larvale e metamorfosi nell’ascidia Ciona intestinalis: ruolo del monossido di azoto
    (2012) Ercolesi, Elena; Palumbo, Anna; Cerra, Maria Carmela
    Sviluppo larvale e metamorfosi nell’ascidia Ciona intestinalis: ruolo del monossido di azoto Lo sviluppo larvale e la metamorfosi dell’ascidia Ciona intestinalis rappresentano un processo molto complesso mediante il quale la larva natante si trasforma in un individuo giovane sessile attraverso una profonda ricostruzione del piano corporeo e la regressione della coda. A livello molecolare, avvengono alcuni processi quali l'attivazione della caspasi-3-simile e della MAPK (Chambon et al., 2002, 2007) e la produzione di monossido di azoto (NO) (Comes et al., 2007). In particolare, è stato dimostrato che l'espressione spaziale di ossido nitrico sintasi (NOS) e di NO è molto dinamica durante lo sviluppo di ciona. Il segnale si sposta rapidamente lungo tutta la larva coinvolgendo il sistema nervoso centrale e la coda nei suoi diversi compartimenti. Inoltre, l'NO regola la regressione della coda, agendo sulla apoptosi mediata da caspasi-3-simile. Il progetto di tesi é stato focalizzato ad uno studio approfondito del ruolo dell'NO durante lo sviluppo larvale e la metamorfosi di C. intestinalis, fornendo nuovi elementi sui bersagli molecolari dell'NO in relazione allo sviluppo ed alla risposta allo stress. Una serie di esperimenti, volti ad esaminare l'andamento e la velocità di metamorfosi in diverse condizioni dei livelli di NO, hanno rivelato che l'NO prodotto nelle larve di ciona contribuisce alla fosforilazione della MAP chinasi ERK, un evento chiave e necessario affinché la metamorfosi avvenga. In particolare, diminuendo i livelli endogeni di NO, trattando le larve alla schiusa con un inibitore della NOS o un agente che lega l'NO, si ottiene un rallentamento della metamorfosi ed una concomitante riduzione della fosforilazione di ERK. Al contrario, un aumento di NO mediante l'uso di un donatore di NO, determina una accelerazione del processo accompagnata da un aumento di attivazione di ERK. Su questa base, é stato ipotizzato un possibile meccanismo per spiegare la fosforilazione di ERK indotta da NO, basato sulla nitrazione di ERK, come suggerito da esperimenti paralleli di immunoprecipitazione, che hanno mostrato la correlazione tra il livello di fosforilazione di ERK e la sua nitrazione. Un altro dato importante emerso da questa tesi è la dimostrazione che l'NO media anche una altra via di trasduzione durante la metamorfosi di ciona che comporta la nitrazione delle proteine. Il trattamento con l'agente nitrante, il perossinitrito, determina una accelerazione della metamorfosi, mentre agenti che legano l'NO provocano un effetto opposto. Un notevole aumento di nitrazione è stato rivelato allo stadio larvale rispetto a quello embrionale ed inoltre ERK e P-ERK sono risultate essere nitrate mediante metodologie immunochimiche. La scoperta di elevati livelli di proteine nitrate durante un processo fisiologico, quale lo sviluppo, riveste particolare importanza alla luce di dati sempre più numerosi in letteratura sulla nitrazione delle proteine quale una nuova via di trasduzione capace di agire direttamente o indirettamente su altre vie. Ulteriori esperimenti sono stati condotti per indagare la risposta allo stress in larve di ciona indotto dalla aldeide prodotta dalle diatomee, la decadienale (DD). Larve trattate con questa aldeide mostrano un ritardo della metamorfosi dipendente dalla concentrazione dell'aldeide e dallo stadio larvale al quale si fa l'incubazione. È interessante notare che il trattamento con DD determina una riduzione della fosforilazione di ERK analogamente a quanto osservato quando i livelli endogeni di NO vengono dimunuiti. Ulteriori studi saranno necessari per delineare il meccanismo con il quale DD influenzi la metamorfosi ed il coinvolgimento dell'NO.
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    Mitochondrial DNA a:nd epigenetics. unexpected complex interactions
    (2012-11-30) Giordano, Marco; Bellizzi, Dina; Grandinetti, Lucio
    In the research of fundamental processes underlying aging and longevity, an emerging field is represented by "aging epigenetics". In fact, different experimental evidences demonstrate as the rate and quality of human aging depend on a complex interplay among genetic, epigenetic and environmental factors. Epigenetics refers to the programmed changes, not involving alteration of DNA sequence, leading different genotypes to phenotypes. DNA methylation is the most studied epigenetic modification occurring in all prokaryotic and eukaryotic organisms. Although the occurrence of this modification and its effects in intracellular processes has been extensively documented for the nuclear genome, conflicting reports regarding the possible presence of methylated cytosines within the mitochondrial DNA (mtDNA) have emerged. In addition, in spite of the hypothesized role of ATP availability on the methylation process , little is known about the role of mitochondrial DNA variability on the methylation status of nuclear genome. The work presented here, has addressed the complex interactions between mitochondrial DNA and epigenetic changes, both investigating the methylation of mitochondrial genome and analyzing the effects of mtDNA variation on the Global methylation of nuclear genome. In fact, a series of in vivo and in vitro investigations are here reported in three sections. In the first two sections, experimental evidences about the presence of methylated cytosines within the mitochondrial control region (D-loop), containing regulator elements for replication and transcription of mtDNA, and within the gene encoding for ribosomal RNA 12S (12S rRNA), are reported. The methylation status of the D-loop was analyzed in both blood DNA collected from human subjects and in DNA from cultured cells by bisulfite sequencing and, consecutively, by methylated/hydroxymethylated DNA immunoprecipitation assays. We found the presence of methylated (5mC) and hydroxymethylated (5hmC) cytosines in all the samples analyzed. MtDNA methylation especially occurs within non-CpG sites. It also emerged that the methylation pattern of the D-loop is strictly cell type-dependent and that it might be an example of RNA-directed DNA methylation (RdDM). The methylation of D-loop occurred mainly in the promoter region of the heavy strand and in conserved sequence Summary blocks (CSBI-III), indicating the involvement of epigenetic modifications in regulating mtDNA replication and/or transcription. Bisulfite sequencing of 12S rRNA region showed the methylation of one CpG site located at 931nt. This site was then analyzed by real-time MGB Probe-based PCR reactions in bisulfite-treated DNA extracted from peripheral venous blood collected from subjects of different age and classified for frailty phenotype. We detected the co-presence of both unmethylated and methylated cytosines in most sample analyzed. Statistical analyses revealed that 12S rRNA methylation displays sex- and age-specific differences, and it is correlated with the health status. In the third section, it is reported that global DNA methylation levels are influenced by mitochondrial DNA inherited variants, probably via the different regulation of OXPHOS machinery. So that, we prove, through cybrid technology, which is an useful approach to reveal possible pathways of communication between mitochondrial and nuclear genomes, as epigenetics processes are modulated in response to the above pathways. In the appendix an additional published paper (Montesanto et al., The genetic component of human longevity: analysis of the survival advantage of parents and siblings of Italian nonagenarians, 2011, Eur J Hum Genet 19: 882-886.), which I worked to during my PhD appointment is reported.
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    Genesi ed evoluzione del magmatismo basico nelle successioni carbonatiche triassiche nel Complesso Alpujárride (Cordigliera Betica) e nelle Unità Appenniniche della Calabria settentrionale
    (2012-11-28) Matrangolo, Gilda; Piluso, Eugenio; Liberi, Francesca; Rojas, Iván Martin
    Permo-Mesozoic extension represents one of the most noticeable geological processes in the western Mediterranean. Triassic sedimentary sequences observed along the Dinaride-Hellenide orogenic belts and in Betic Cordillera are locally related with a basic magmatism in an extensional tectonic setting. Carbonates sequences which include basic rocks can be observed in the Alpujarride Complex (central-eastern Betic Cordillera, Spain) and in the Lungro-Verbicaro Unit (northern Calabria). Betic Cordillera represents an important orogenic belt sited in the southern and southeastern side of the Iberian Peninsula and it is commonly divided into three main geological units: the Betic External Zone, Campo de Gibraltar Complex and the Betic Internal Zone, which include various tectonostratigraphic units arising from previous paleogeographical domains developed during the Mesozoic, as a consequence of the break-up of the Pangaea supercontinent. According to Iannace et al. (2007), the Meso-Cenozoic carbonates sequences outcropping in northern Calabria can be grouped into three tectonic units: the Lungro-Verbicaro Unit, the Cetraro Unit and the Pollino-Ciagola Unit. The Lungro-Verbicaro Unit is represented by a thick sedimentary succession affected by HP-LT metamorphism and consisting of phyllites and metarenites with carbonate intercalations in its lowermost part of Middle Triassic. Basic rocks can be found as a small intrusive complex within the Anisian phyllites and the Ladinian-Carnian carbonates of the Lungro-Verbicaro Unit. As Mesozoic geodynamic processes, since the opening of the Tethys, are recorded in the above rocks, the attention was focused on these two areas. The aim of this research was to study these basic magmatic rocks in order to obtain a better interpretation of the extensional tectonic process and to recognize a possible hydrothermal metamorphic overprint. In fact, the latter process is suggested by significant mineralizations observed in the outcrops of the Alpujarride Complex, due to the activity of a hydrothermal metamorphism in the Betic area. Basic rocks were characterized from a petrological and geochemical standpoint with the purpose of determining the characteristics of their source. A multidisciplinary approach was followed in both areas. Firstly, a field geology work (with the addition of photo-geological analyses for the Betic area) was performed to constrain relationships between basic rocks and wall rocks. Secondly, laboratory analyses were carried out in order to determine petrographic, petrological and geochemical characteristics of study samples. Petrographic analyses were performed using both the optical and scanning electron microscopy techniques, whereas petrological data were obtained by the electron microprobe. Lastly, geochemical composition of study rocks was characterized by X-ray fluorescence spectroscopy (XRF), and the obtained data were processed using suitable diagrams.
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    Evolutive significance of hybridization in Mediterranean deceptive orchids
    (2012-11-27) Luca, Alessia; Musacchio, Aldo; Pellegrino, Giuseppe
    Università della Calabria
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    Genetic diversity assessment in Pinus laricio Poiret populations using microsatellites analysis and inferences on population hystory
    (2012-12-07) Bonavita,; Musacchio, Aldo; Regina, Teresa M. R.; Bernardini, Vincenzo
    Forests are complex and dynamic ecosystems characterized by trees with remarkable longevity and reproductive forms, particularly, cross-pollination which tend to increase their degree of genetic diversity. If on the one hand, cross-pollination between different individuals continuously shuffles the genetic material ensuring heterogeneity, on the other hand, an effective pollen and seeds dispersal ensures a reliable gene flow between individuals and, therefore, high levels of intra-specific variability. Therefore, more genetically different individuals are, greater is their ability to adapt to changed environmental conditions. Pinus laricio Poiret, usually considered as the most divergent and genetically original subspecies of European black pine (Pinus nigra Arnold), is the most widespread conifer occurring in Calabria, Sicily (Etna Mount) and Corsica. In Calabria, it grows on the Aspromonte mountain and mainly on the Sila plateau, where laricio pine forests cover more than 40,000 ha and characterize the landscape from 900 m up to 1,700 m above sea level. Thermophilic, xerophilous and heliophilous species, Pinus laricio can reach large sizes and 350 years of age, as documented for the Fallistro's Giants Biogenetical Reserve, within the Sila National Park. To the best of our knowledge, until now no studies have been conducted on the genetic diversity of Pinus laricio forests in their natural range of distribution. Furthermore, an in-depth investigation on the within- and among-population genetic differentiation is greatly needed to preserve Pinus laricio diversity, but also to establishing appropriate strategy of management and conservation of this specie. In this thesis, genetic polymorphism among geographically distant laricio pine natural populations from Sila, Aspromonte, Etna, and Corsica National Parks was detected using chloroplast and nuclear SSR markers. Both types of markers revealed that the higher diversity was found mainly within populations, while there were low levels of differentiation among populations, very likely associated with extensive gene flow and strong anthropogenic influence. However, a geographical discontinuity was identified, clearly indicating genetic subdivision of the investigated laricio pine populations at both inter- and intra-population level. All populations within the Sila area were found differentiated from the rest, particularly the Fallistro population that appeared the most genetically distinct. Results issued from this study shed light on the gene pool and evolutionary history of Pinus laricio populations providing a genetic perspective for exploitation and conservation of this not yet sufficiently explored resources in forestry.
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    Effetti neuro-comportamentali del rame nei teleostei: ruolo dell'HSP90 e del sistema ORXergico
    (2012-11-29) Zizza, Merylin; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Facciolo, Rosa Maria
    Tra i metalli, il rame (Cu2+), sebbene essenziale per il corretto metabolismo corporeo, può risultare un potente agente tossico in grado di promuovere pericolosi eventi nocivi, soprattutto nei pesci. Ad oggi, sono poche le informazioni sulla neurotossicità ramedipendente e le risposte attivate per la difesa e riparazione da tale tossicità. Su questi presupposti, nel presente lavoro sono stati investigati gli effetti del cloruro di rame (CuCl2), a diverse concentrazioni e tempi di esposizione, sia a livello comportamentale che neuronale nel teleosteo d’acqua dolce, Carassius carassius, e marino, Thalassoma pavo. Da un punto di vista molecolare, l’attenzione è stata indirizzata alle variazioni trascrizionali dell’Heat Shock Protein 90 (HSP90), chaperon con ruolo critico sia in condizioni fisiologiche che di stress. Alla luce di recenti evidenze che propongono il sistema orexinergico come cruciale nella coordinazione delle reazioni fisiologiche allo stress, è stata valutata anche la capacità dell’orexina-A (ORX-A), somministrata ogni giorno intraperitonealmente (10 ng/g peso corporeo) durante l’esposizione al Cu2+, di modulare gli effetti neuro-comportamentali di tale metallo nei suddetti teleostei. Il trattamento a breve termine (48h) con due concentrazioni di metallo, selezionate mediante screening preliminari in Carassius carassius (1.45 mg/L e 0.30 mg/L CuCl2) e Thalassoma pavo (1.07 mg/L e 0.25 mg/L CuCl2), ha causato evidenti alterazioni comportamentali. In particolare, il feeding è risultato notevolmente (p<0.001; p<0.01) ridotto, vs i controlli, in Carassius carassius e in Thalassoma pavo, rispettivamente. Nel primo pesce, la concentrazione di 1.45 mg/L ha causato anche una moderata (p<0.05) riduzione dello swimming, accompagnata da un simultaneo incremento del resting state. In modo analogo, in Thalassoma pavo, la riduzione dello swimming durante l’esposizione alla più bassa concentrazione, si è tradotta in un concomitante incremento del resting state. Nei teleostei marini, esposti a 1.07 mg/L di metallo, l’assenza di effetti significativi sul rest era dovuta alla comparsa di abnormal motor behaviors, caratterizzati da perdita di equilibrio e movimenti repentini ed improvvisi. In Carassius carassius tali atteggiamenti insorgevano solo moderatamente dopo 48h di esposizione alla alta concentrazione. Inoltre, durante l’esposizione, entrambi i teleostei mostravano una considerevole tendenza a nuotare verso la superficie (swimming towards surface). Accanto agli effetti sul comportamento, l’Amino Cupric Silver Stain ha anche mostrato segni di neurodegenerazione a carico dei neuroni, soprattutto nel nucleo laterale del telencefalo dorsale (Dl) degli esemplari esposti alle alte concentrazioni di contaminante. Parallelamente, l’ibridazione in situ ha fatto registrare nell’encefalo di Thalassoma pavo, trattato con la concentrazione più alta, un’up-regulation dell’HSP90 in differenti nuclei, come Dl (+87%). In Carassius carassius la risposta trascrizionale è stata invece meno evidente, con moderati incrementi dell’mRNA rinvenuti, ad esempio, nella valvola del cervelletto (VCe; +31%), in seguito a trattamento con la più alta concentrazione che causava anche moderate down-regulations a livello del telencefalo. E’ stato interessante notare che molte delle alterazioni comportamentali venivano ridotte dalla somministrazione di ORX-A, soprattutto a livello del feeding di entrambi i teleostei. In Carassius carassius si è potuto osservare, inoltre, una riduzione degli abnormal motor behaviors e dello swimming towards surface. Anche a livello neurodegenerativo, l’ORX-A è stata in grado di prevenire i danni indotti dal Cu2+, come nel Dl di Carassius carassius esposto alla più alta concentrazione. Dal punto di vista molecolare, l’ORX-A ha prevenuto la down-regulation indotta dal metallo in Dl, favorendo addirittura una moderata up-regulation del trascritto in TLo (+32%) di Carassius carassius esposto a 1.45 mg/L di CuCl2, rispetto ai controlli. Anche in Thalassoma pavo, il neuropeptide induceva una significativa up-regulation dell’espressione di HSP90, come nel nucleo laterale del telencefalo ventrale (Vl; +92%) durante esposizione alla concentrazione più bassa di CuCl2. Quando i pesci esposti al Cu2+ per 48h sono stati trasferiti in acqua priva di metallo, molti deficit neuro-comportamentali erano, almeno parzialmente, ripristinati. Inoltre, quasi tutti i nuclei encefalici di entrambi i teleostei, esposti alla più alta concentrazione, hanno mostrato incrementi significativi dell’mRNA per l’HSP90, sia rispetto al precedente trattamento che ai controlli. Alla luce dei dati ottenuti e in virtù del fatto che la bassa concentrazione aveva fatto rinvenire alterazioni neuro-comportamentali più lievi, in alcuni casi recuperabili, è stato interessante verificare gli effetti di questa stessa concentrazione in un trattamento cronico (21 giorni). Nel corso di tale trattamento, il feeding di Carassius carassius era drasticamente ridotto, rispetto ai controlli, a partire dal giorno 7 di esposizione mentre in Thalassoma pavo la riduzione diveniva elevata al giorno 14. A livello encefalico, si riscontrava una più estesa degenerazione che colpiva molti più campi neuronali, compreso il nucleo diffuso del lobo inferiore (NDLI). Al contempo, il trattamento cronico era responsabile di una generalizzata up-regulation dell’HSP90 in Thalassoma pavo e di un effetto trascrizionale sito-specifico in Carassius carassius. In quest’ultimo teleosteo, infatti, si riportavano down-regulations nel telencefalo (~-30%) e in NDLI (-55%), ed upregulations in TLo (+30%), VCe (+43%) e nel corpo del cervelletto (CCe; +52%). La somministrazione di ORX-A al 21 giorno, sebbene causasse un’attenuazione degli effetti del Cu2+ sul comportamento, non era però capace di ridurre i danni neuronali e, a livello trascrizionale, non influenzava in modo efficiente l’espressione dell’HSP90 Nel complesso, i risultati di questo lavoro di Dottorato forniscono importanti evidenze degli effetti neuro-comportamentali del Cu2+ in Carassius carassius e Thalassoma pavo, sottolineando il coinvolgimento dell’HSP90 nei meccanismi di protezione e riparazione innescati a livello encefalico. In aggiunta a ciò, per la prima volta, si suggerisce l’implicazione del sistema ORXergico nell’attivazione di risposte adattative allo stress indotto dal Cu2+, sia nei teleostei marini che d’acqua dolce
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    I nitriti come molecola segnale: effetti diretti e indiretti sulla regolazione dell'attività cardiaca
    (2012-11-20) Montesanti, Gabriella; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Pellegrino, Daniela
    Nitrite anion is a physiological NO storage form and an alternative way for NO generation, recently emerged as a cardioprotective endogenous modulator. Using Langendorff perfused rat hearts, as paradigms of mammals heart, we explored nitrite influence on the Frank-Starling response. We demonstrated that, like NO, exogenous nitrite improves the Frank-Starling response in rat heart as indicated by Left Ventricular Pressure (LVP) and the maximal rate of LVP decline (LVdP/dtmax), used as indexes of inotropism. Noteworthy, the minimal negative derivative of intraventricular pressure, LVdP/dt min, used as indexes of lusitropism, was positively affected by nitrite, suggesting the anion involvement not only in the systolic but also in the diastolic phase. This positive influence of nitrite was unaffected by endocardial endothelium impairment and NOS inhibition. In addition, the effect resulted sensitive to NO scavengers, independent on nitroxyl anion, and mediated by a cGMP/PKG-dependent pathway. These results suggest that nitrite acts as a physiological source of NO modulating the stretch-induced intrinsic regulation of the mammals heart. Moreover, nitrite affects numerous biological processes through NO-independent pathways (Bryan et al., 2005), including the S-nitrosylation of thiol-containing proteins (Foster et al., 2003). The mechanisms underlying these phenomena, until now not fully understood, are of great interest because of their cardiovascular therapeutic potential. In the last part of this study we analysed in the rat heart whether nitrite affect S-nitrosylation of cardiac proteins and the potential targets for S-nitrosylation. Rat hearts, perfused according to Langendorff, were exposed to nitrite and then analysed by Biotin Switch Method. We showed that nitrite increased the degree of S-nitrosylation of a broad range of membrane proteins. Further analysis, conducted on subfractioned proteins, allowed us to identify a high level of nitrosylation in a small range of plasmalemmal proteins (45-50 kDa). The increment in S-nitrosylation at this location was characterized by using an anti-Kir2.1 rabbit polyclonal antibody. We also verified that this effect of nitrite is preserved in the presence of the NO scavenger P-TIO. Finally, we wanted to investigate the direct effects of nitrite using two specific inhibitors of the major nitrite reductase in the heart, xantine oxidoreductase and citocrome P450 (allopurinol and ketoconazole respectively). The effect of nitrite in the presence of these inibitors is a bit reduced compared to control. A further analysis of this result, we used nitrite in the presence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), a specific inhibitor of the nitroxyl anion (HNO). In this case, unlike that observed with the P-TIO, the effect of nitrite is significantly reduced. Our results suggest, for the first time, that nitrite represents a direct S-nitrosylating agent in cardiac tissues and that Kir2.1 channels are one of the targets. These observations are of relevance since they support the growing evidence that nitrite is not only a NO reserve but also a direct modulator of important functional cardiac proteins
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    Necrophagous species living in Calabria and their application in forensinc field
    (2012-11-28) Greco, Silvia; Brandmayer, Pietro; Bonacci, Teresa; Cerra